解忧小工具｜免疫荧光知识点小课堂

乔帮主

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种强大的技术。
免疫荧光的介绍
免疫荧光是根据抗原抗体反应的原理，先将荧光素偶联到已知的抗原或抗体上，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测细胞或组织中的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受外来激发光的照射而发射荧光，发射的荧光可通过显微镜观察到。通过荧光强度与表达位置等指标，对所要检测的抗原或抗体进行定性、定量、分布和迁移分析。由于其具有特异性强、敏感性高、速度快等优点，是一个很好的检测技术工具。
免疫荧光实验的类型
在进行免疫荧光检测时，首先对细胞或组织进行固定和透化处理。进行免疫染色时，荧光团与目标抗原的抗体结合，然后使用成像显微镜观察荧光信号。根据使用的抗体和所需的信号扩增，免疫荧光可分为直接和间接两种类型。


免疫荧光是实验过程中要设置对照实验
阳性对照:用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。
阴性对照:与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。
免疫荧光实验常见问题及解决方案
A.信号微弱或没有信号
可能原因及建议：
a)       目的蛋白本身表达量低/蛋白需要诱导表达——使用蛋白印迹法确认蛋白表达情况/参考文献找到诱导方法和阳性对照；
b)       样本保存不当——避光条件要充分，封片选择防淬灭封片剂，染完色尽快拍照；
c)       切片样本保存时间过长——最好现用现切，防止蛋白变性解离；
d)       抗体浓度过稀——设置浓度梯度摸索合适的抗体浓度；
e)       一抗不好用——建议做阳性对照确认抗体的有效性；
f)        二抗使用不当——检查是否和一抗宿主相匹配；
g)       错误的激发波长——确保激发和检测与荧光基团激发光波长相匹配。
B.染色背景高
可能原因及建议：
a)       封闭不充分——使用与二抗相同物种的血清，提高封闭时间；
b)       样本过分干燥——在湿盒中孵育抗体，避免样本干燥；
c)       抗体浓度过高——优化抗体浓度；
d)       抗体孵育时间过长或温度过高——调整孵育条件，注意夏季和冬季室温变化；
e)       样本干片或脱片——试剂没有完全浸没组织，样本处理不当导致脱片，建议充分浸没组织；
f)        清洗不到位——充分洗涤，适当增加洗涤次数；
g)       样本自发荧光——检测未染色样本自发荧光，更换陈旧甲醛固定液，或采用自发荧光去除试剂，提前提取自发荧光信号在检测时抠掉；
h)       组织内出血坏死部分太多——动物提前灌注处理减少凝固血液残留；
i)         切片太厚——冰冻切片一般6-8μm，石蜡切片一般3-5μm；
j)         非特异性抗体结合——进行对照实验检测；
k)       曝光时间调整不当——降低曝光时间。
C.细胞/组织形态破坏严重
可能原因及建议：
a)       组织切片从载玻片上脱落或切片有气泡——适当增加固定时间；
b)       组织切片撕裂或有褶皱——切割刀片不太锋利，考虑重新切片；
c)       细胞或组织固定不充分，自发裂解——适当增加固定时间，使用交联性固定剂。
今天小编先对免疫荧光的知识点进行小总结，后面会针对免疫荧光的实验处理进行分享。

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