常见的PCR技术有哪些？

空白派

能否介绍一下？

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队长是我

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PCR实验包括三大主要的热循环步骤 ，在这个过程中需要多种必要的反应成分 ，通过对PCR的设置做相应的调整，便可以获得一些特殊的实验结果，如产率提高，特异性增强或反应时间缩短等。

常用PCR方法及其核心优势


热启动PCR
常用于增强PCR扩增的特异性。该方法主要利用抗体、亲合配体、适体或化学修饰物等酶修饰酶，来抑制室温下的DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR体系配制阶段引物与模板、引物与引物之前的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。由于DNA聚合酶在室温下的活性被抑制，所以，热启动技术为在室温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，且不会影响特异性和扩增能力。


什么是热启动PCR？
当反应体系配制好后，在反应初始加热阶段或“热启动”阶段，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活。具体激活时间和温度取决于DNA聚合酶以及热启动修饰物的性质。对某些DNA聚合酶而言，有时激活和起始变性步骤可以合并为一步。



图 .基于抗体热启动技术的DNA聚合酶。

降落PCR
另一种提高PCR反应特异性的方法是调整PCR循环的参数。在降落PCR中，前面几个循环的退火温度设定为比引物的最高熔解温度（Tm）再高几度。
较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物-模板复合物的形成，因此可减少不希望出现的扩增。因此，在PCR起始阶段提高退火温度，可减少非特异性PCR产物，增加特异性扩增。
需要注意的是，虽然较高的退火温度能够防止引物二聚体形成和非特异性引物结合，但同时也可能加剧引物与目的序列的解离，从而降低PCR得率。为克服这一问题，在最初几个循环中，通常会将每个循环的退火温度降低1°C，以获得足量的目标扩增子。
一旦退火温度达到或“降落”至最佳温度（通常比最低引物Tm低3-5°C），剩下的循环都维持此退火温度。通过这种方法，在PCR过程中，所期望的PCR产物得到有选择性的增加，同时保证很少或不发生非特异性扩增。
巢式PCR
巢式PCR是标准PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。在此方法中，需要设计两对PCR引物：一对（外引物）在目标扩增区域的侧翼，另一对（巢式引物）对应于待扩增的DNA区域。
其中，外引物用于第一轮PCR，以扩增含有延伸侧翼区域的区域。随后，巢式引物用于第二轮PCR，并以第一轮PCR产物为模板。
如果第一对引物（外引物）的错配导致非特异性产物被扩增，相同的非特异性区域被第二对引物识别并继续扩增的可能性非常小，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的一个优势在于：有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。
快速PCR
在快速PCR中，通过缩减PCR步骤所需时间来完成更快的扩增，且不会影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于具有高扩增能力的DNA聚合酶，这类聚合酶在每个结合中可引入更多的核苷酸。
高合成能力 Taq 聚合酶所需的延伸时间仅占低合成能力Taq聚合酶所需时间的1/2至1/3，却能维持较高的扩增效率。此外，如果引物的退火和延伸温度相差无几，则可将它们合并为一步，以进一步缩短PCR时间。这一过程也被称为 两步PCR法。
当使用低合成能力的 Taq 聚合酶时，如Taq聚合酶，快速循环条件可能适用于 <500 bp左右的短片段。扩增如此大小的片段通常不需要延长聚合时间，因此可缩短PCR方案中的延伸步骤时间。
为确定最短延伸时间，同时又不损失产物得率，可采用一系列延伸时间递减的方式（几秒）优化PCR。每个目的片段和引物对都可能会产生变化结果，所以需要在特定条件下对快速PCR进行优化。
快速PCR的另一种调整方式是缩短变性时间，将变性温度提高至98°C。使用这种策略时应注意，非高度热稳定的酶在这种高温环境下易于变性。
使用低合成能力DNA聚合酶实现快速PCR时所用的反应参数。


使用可实现快速循环的热循环仪和薄壁 PCR管，分别有助于实现快速变温和高效热转移，从而能够大大加速PCR。
直接 PCR
直接PCR是指直接从样品扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。直接PCR中，在高温变性阶段，诸如细胞、组织等材料在特殊的缓冲液中被裂解，释放出DNA。因此这种方法简化了实验流程，减少了动手操作时间，同时可避免纯化步骤DNA的损失。



图 .常规PCR和直接PCR对比。

推荐使用具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA一起被释放到裂解液中，它们会抑制PCR反应。而具有高合成能力的DNA聚合酶能够耐受这类抑制剂，使直接PCR扩增成为可能。具有高合成能力的酶通常具有更高的灵敏度，因此可从未纯化的样品中成功扩增微量DNA。
高GC含量PCR
具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。
为了扩增高GC含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使DNA聚合酶能够读取到序列。为了克服强GC相互作用，最常用的方法是使用DMSO等PCR添加剂或辅助溶剂来帮助DNA变性。然而，这些试剂通常会降低引物的 Tm，所以退火温度也需进行相应的调整。
高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量PCR。超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因为较高的变性温度（如，使用98°C代替95°C）可能会促进双链解离和PCR扩增。
多重 PCR
多重PCR可在同一PCR反应管中同时扩增多个不同的片段。多种PCR不仅意味着节省时间、试剂和样品，还能够同时对比多个扩增子。
当一个PCR管中有多个引物对时，如在多重PCR中，因无法仅针对一个引物对或目的片段进行反应优化，而是要考虑到所有引物和靶标，所以可能会出现非特异性扩增和效率降低。因此，为尽量减少由非特异性扩增导致的错配，应对引物进行精心设计。
首先，引物序列应尽可能与其目的序列一一对应，并且所有引物的 Tm相差不应超过5°C。在多重PCR开始前，应利用单个PCR反应验证每个引物对的特异性和扩增效率。
此外，扩增子应具有不同的大小，从而能够通过凝胶电泳对其进行分离鉴定。除了引物设计和扩增子大小，使用热启动DNA聚合酶和专为多重PCR设计的缓冲液也将有助于获得成功的PCR结果和提高反应特异性。
尽管多重PCR常作为终点法PCR，但由于其在多重标记和检测中的能力 ，将其用于实时荧光定量PCR也变得越来越流行。另外，多重实时荧光定量PCR也常被用于遗传标志物的检测，用于人类身份鉴定。
长片段 PCR
长片段PCR通常是指扩增大于5kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用 Taq DNA 聚合酶（用于快速延伸）和高保真酶（用于提高准确性）的混合物。
随着具有高合成能力的高保真DNA聚合酶被发明出来，现在能够在更短的时间内实现更准确的长片段PCR。通过在DNA聚合酶中设计一个较强的DNA结合结构域，从而使其能够在短时间内扩增长片段（如，来自gDNA的 >20 kb 片段），实现高合成能力。此外，极高的保真度（如， Taq 聚合酶保真度的 >100倍）还有助于确保长片段扩增的低错误率。



表 .在长片段PCR和克隆中使用高合成能力高保真DNA聚合酶的优势。

DNA聚合酶的高合成能力可显著缩短长片段PCR的反应时间（在本例中，时间缩短了一半），而高保真度可减少筛选含正确插入片段克隆的工作量。
什么是高保真PCR？
当扩增>10 kb的目的片段时，应根据以下5个关键点对PCR方案进行优化：
1. 确保使用高质量、高纯度的DNA样本。
2. 如果DNA聚合酶的热稳定性较低，则需要使用更多量的酶，以弥补因延长循环时间导致的活性损失。
3. 降低退火和延伸步骤的温度，有助于引物结合。
4. 适当延长PCR步骤的持续时间，有助于模板DNA的完全解离及引物的结合。
5. 适当延长PCR延伸时间，可确保目标区域的全长复制。
反向PCR
反向PCR起初设计用于确定邻近未知区域的序列。它有助于研究基因的启动子序列；致癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座；以及病毒基因整合。该方法之所以被称为反向PCR，是因为引物设计用于向两边延伸而不像常规PCR中朝着彼此延伸。如今，反向PCR常被用于定点突变，复制一个具有预期突变的质粒。
在研究基因组DNA未知序列的传统工作流程中，首先进行限制性酶切消化和连接，再进行反向PCR，随后对PCR扩增子进行测序。对于gDNA消化，需选用一种限制性内切酶进行酶切，以获得长度合适且能够自我连接的片段。
同时，选定的限制性内切酶不可剪切已知序列，从而使连接发生于侧翼未知序列之间。使用低浓度的酶切DNA片段优化连接步骤，使其倾向于自我连接而非多片段连接（即形成连环体）。
完成自我连接后，从DNA的已知区域启动反向PCR。所获得的扩增子每个末端都含有部分已知DNA序列。随后，可从末端开始对这些扩增子进行测序，检测上述已知序列的相邻区域。
定量PCR
序列的扩增程度（得率）取决于模板起始量，PCR常用于对样品中的DNA进行定量，其中，最常见的应用是基因表达定量。终点PCR方法虽然可行，但它存在一重大缺点，即需要通过凝胶电泳确定得率，从而限制了检测灵敏度。
此外，定量是在PCR末期进行的，而此时的扩增已达到平台期，因此，DNA凝胶染色强度无法与DNA起始量呈线性相关。尽管如此，若在到达平台期之前通过终点PCR对基因表达进行半定量分析，可使用连续稀释的DNA样品作为起始物，或收集指定PCR循环的扩增子，并根据凝胶染色强度估计基因表达量。
直到1993年，Higuchi等报道称使用荧光信号对PCR扩增进行实时监测，才克服了终点PCR定量的局限性。这一技术为我们今天所熟知的定量PCR(qPCR）奠定了基础。1997年，第一款qPCR仪进入市场，使PCR能够准确定量基因表达和拷贝数。qPCR依靠对指数期目的片段扩增荧光信号的实时监测，克服了终点PCR定量的缺点。尽管qPCR能够定量检测相对和绝对基因表达，但是其检测能力限制了定量性能。
20世纪90年代与实时荧光定量PCR同时开发的数字PCR （也称为极限稀释PCR）实现了真正的DNA样品绝对定量。在数字PCR中，是将高度稀释的DNA样品分配到多区室芯片中，使每个区室最多含有一个拷贝的靶标。然后，对每个区室内的扩增进行检测，获得阳性或阴性结果（分别为1或0个模板拷贝；即， "数字" 结果）。
最后，使用统计模型（泊松分布），根据阴性反应部分确定样品的拷贝数，无需定量已知样品（标准品）。除了基因表达和拷贝数定量，数字PCR还适用于区分低频等位基因、病毒滴定以及下一代测序文库的绝对定量等应用。利用数字PCR进行绝对定量的一般工作流程。
总之，改进的PCR实验方案和改进的DNA聚合酶旨在改善PCR扩增的结果。虽然PCR的基础概念并未发生改变，但新型PCR方法将继续推动和简化分子生物学研究。

队长是我

一、引言：
        聚合酶链式反应简称pcr，pcr是体外酶促合成特异dna片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有dna，rna的地方。pcr又称无细胞分子克隆或特异性dna序列体外引物定向酶促扩增技术。
        对流 PCR （convectiion PCR）是一种新型的PCR，扩增试剂在一个封闭的空间中，维持其上下表面温度保持不变，产生热流体上升冷流体下降的一种现象，是一种将上下温差引起空间内流体密度变化引起的热对流应用于 DNA扩增的一种技术。单一热源驱动的对流 PCR 扩增如下图 1 所示：




        如图中所示，反应管底部液体因受热会导致密度减小，此时在浮力的作用下液体向反应管上方运动，但上升的过程中液体的温度逐渐降低，密度增大，直至到达反应管顶部时，在自身重力的作用下液体开始下沉，当到达反应管底部时，会再次进行下一次循环流动。
        如此反复，通过反应管内液体的热对流运动。PCR 试剂可以反复经历不同的温度变化从而完成 PCR 扩增。当PCR 试剂位于反应管底部时，由于温度较高，DNA 双链变性形成 DNA 单链；当 PCR 试剂流动至反应管顶部时，在较低温度条件下，PCR 试剂中的引物与 DNA 单链特异性结合，即退火过程；随后 PCR 试剂下沉，在反应管中部时，DNA 聚合酶完成延伸反应。这样，液体进行一次对流便可完成 PCR 反应的一个循环。

二、论文分析：

  韩国科研人员发表论文：Natural Convection PCR in a Disposable Polymer Chip，提出内径为 1.6mm 的 U 型环状玻璃毛细管作为 PCR 试剂容器。该平台采用一个等温加热器加热毛细管的底部，采用 CCD 相机实时采集扩增荧光信号。
论文摘要如下：




        该装置由4个PCR模块组成，4个 PCR 模块(每个模块可以独立控制)集成到一个一体式 PCR 装置中，该装置包括 ADC 变压器（24 V DC 输出），控制键盘，LCD 显示器等。电压可以选择 24v 电池或 220v 交流电。每个周期的 PCR 循环时间可以通过倾斜芯片的方向(或加热块) 来调节(相对于重力方向)。4个PCR模块的结构和布局如下图所示：



​

        在每个PCR模块内部，当 PCR 试剂通过芯片入口腔注入后，将芯片垂直插入事先预热的加热槽中，该槽由三个提前加热好的铝制金属块 ，三个金属模块对应三个温区(变性、退火、延伸)) 构成。三个提前加热不同温区的加热模块如下图ADE所示：




        从上图发现：3个小的铝制金属模块，在其下面由薄膜加热器和热电偶位于对应的铝制金属块上，用于加热和测定对应区域的温度。加热模块通过连接器插入控制板。通过相应的控制算法，来控制开启/关闭控制装置来调整金属块的温度。
   铝制金属块的温度，传递到生物芯片的不同部位从而产生对流效果。三个金属块对应的芯片温度区域，仿真如下：





        通过仿真，理论和数值计算获取了最优通道结构。变性、退火和延伸分别位于图中左、右和底部，PCR 反应物沿虚线箭头循环。这种连续的循环流是由浮力对流 形成的，当 PCR 反应物沿着循环通道循环一次时，一个 PCR 循环（三个阶段：变性、退火和延伸）就完成了。两个分支通道连接到环形通道，用于将 PCR 样品引入环形通道。通道基板(13 x 35 x 1.3  ) 采用 PC 制作。一张厚 0.3mm 的 PC 薄膜上钻有 直径 1mm 的入口孔和出口孔。基于该仿真模型设计出来的芯片如下图所示：




        传统PCR 的温度条件限制了热功率，但是，循环流很容易因环的尺寸发生改变，如长度、高度和宽度。理论上，当浮力流向上移动时，施加在浮力流上的力是正的，而当流动方向与重力方向相反且平行时，其力最强。此外，随着加热通道的长度和面积变大，浮力会变得更强。然而，在通道很长的情况下，抑制对流的粘性剪切力 (viscous shear force) 和循环时间都会增加。
        为了更好地，控制流体形成对流。芯片通道基板采用紫外线粘合剂与作为盖子的 PC 薄膜粘合，并通过 60 s 的紫外线照射进行气密密封。约20μl 的样品被用于填充芯片。填充一个没有气泡的封闭回路对于沿回路的流动循环非常重要，因为对流流动可能会被气泡阻碍甚至停止。
       在这个过程中， 为了将 PCR 反应物无气泡地填充到通道中，在环形通道内设计了一个毛细中断阀。在通道底部放置斜坡结构以形成毛细中断阀。这使得毛细流在通道宽度和高度上都经历了突然膨胀。 样品从入口进入，充满一个分支通道后沿着岔路分成两股流动流。一股流体在毛细中断阀处停止，而第二股流体通过变性、延伸和退火区域。两股流体在中断阀处汇合，并沿着与出口相连的分支通道移动。至此，PCR 试剂被成功填充到整个环形通道内，没有任何气泡形成。样品的填充顺序如下图所示：




     最后，作者提出一种便携的独立运行的热对流PCR，该PCR 反应时间可以控制在5分钟以内。不仅如此，还可以通过倾斜设备来调整来调整反应时间。倾斜角越大，试剂的循环速度就越慢。

参考文献：
1、Natural Convection PCR in a Disposable Polymer Chip.
2、百度百科及其相关报道
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同花顺

准备好了没有，史上最全PCR知识来了：
PCR 技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)也就是我们通常所称的 PCR 反应，自 1971 年发明以来，已经在医学、微生物学、植物学和动物学等领域得到广泛的应用，特别是 2020 年新冠疫情以来，采用核酸筛查的方法寻找新冠病毒感染人群，可谓是一种快速、适用于大 规模人群的筛查手段，同时被当成阳性病例确诊手段之一，自此 PCR 反应被广大的普通民 众所了解和熟知。众所周知，PCR 反应是测序、分子克隆技术的基础，PCR 技术的发明将 分子生物学技术向前推进了一大步。
生命科学是解决人类重大生命问题的科学，PCR 技术的诞生成为生命科学的生长点， 使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。20 世纪 50 年代，遗传物质脱氧核糖核 酸(DNA，Deoxyribonucleicacid)双螺旋结构的发现，开创了从分子水平研究生命活动的新 纪元。此后，遗传信息由 DNA 通过 RNA(Ribonucleic acid，核糖核酸)传向蛋白质这一“中 心法则”的确立以及遗传密码的破译，为基因工程的诞生提供了理论基础。
随着 PCR 技术的发展，对 PCR 技术的使用从测序和分子克隆，逐渐应用于病毒、细菌、 真菌和物种的鉴别和鉴定。甚至，我国的食品安全国家标准(方法标准)中也引入了 PCR 技术。PCR 技术具有高灵敏性、快速和高通量的特点，目前在疾病诊断、致病微生物鉴定、 物种鉴别等领域得到推广和应用。
PCR 技术发展历程

1953 年 4 月 25 日，沃森(James Dewey Watson)和克里克(Francis Harry Compton Crick) 在《Nature》发表 DNA 双螺旋结构模型，自此开创了分子生物学时代，这一发现也被誉为 20 世纪以来生物学方面最伟大的发现，使生命科学的研究深入到分子层次。从此以后，科 学家一直在探索研究 DNA 的新方法，新技术。1971 年，印裔生物学家科拉纳(Har Gobind Khorana)提出“DNA 体外合成”的设想，即经过 DNA 变性，与合适引物杂交，利用 DNA 聚合酶延伸，不断重复该过程便可克隆 tRNA 基因。但是当时引物合成技术水平有限，尚未 发现较好稳定性的 DNA 聚合酶，所以科拉纳的设想逐渐被遗忘，当时 DNA 体外扩增技术 并未获得全面推广。1973 年，我国台湾科学家钱嘉韵从黄石公园热泉中的嗜热细菌，海栖 热孢菌(Thermus aquaticus)中分离出耐高温的 Taq DNA 聚合酶，并于 1976 年发表于《细 菌学杂志》(J. Bacteriol)。

第一代传统 PCR 技术

1983 年 4 月的一个星期五的晚上，美国化学家穆利斯(Kary Banks Mullis)驾车在高速 公路上飞驰，脑海中猛然闪现出 DNA 双链的结构，以及让 DNA 片段不断自我复制的想法。 1984 年 11 月，穆利斯对一 49 个碱基对(bp，base pair)的 DNA 片段进行了 10 个 PCR 循 环的复制扩增，成功完成了第一次 PCR 实验。1985 年，穆利斯阐述了 PCR 技术的基本原理， 即在试管中模拟细胞内 DNA 复制，具体包括提供 DNA 体外合成合适的条件，即模板 DNA、 寡核苷酸引物、4 种核苷酸(dNTP，deoxy-ribonucleoside triphosphate)、DNA 聚合酶，合适 的缓冲液体系，通过 DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。最初，DNA 聚合酶使用的是 大肠杆菌 DNA 聚合酶，该聚合酶不耐热，每次加热变性 DNA 后都要重新补加。1986 年， 穆利斯将钱嘉韵发现的耐高温 Taq DNA 聚合酶应用于 PCR 反应，极大地减化了 PCR 工作 流程。
当时，PCR 实验仍需纯手工操作:设置 3 个不同温度的水浴槽，然后按照高温变性、 退火、延伸的顺序，将 PCR 管浸泡在不同温度水浴槽中，完成 DNA 变性、引物结合和 DNA 合成的 PCR 循环，完成一次 PCR 实验需要几十个循环，十分费时费力。1988 年穆利斯所在 的西特斯(PE-Centus)公司发明了第一台 PCR 自动化循环仪，在耐高温 Taq DNA 聚合酶的 配合下，实现了 PCR 技术的实际应用。1989 年，美国《Science》杂志将 PCR 列为十余项
重大科学发明之首，并将 Taq DNA 聚合酶命名为“年度分子”。1993 年，穆利斯因 PCR 技术被授予诺贝尔化学奖。
第二代定量 PCR 技术

20 世纪 90 年代早期，罗氏(Roche)的科学家团队率先在 PCR 反应体系中加入溴化乙 二胺，将样品置于紫外光下检测 PCR 终点荧光信号，可实现目标基因的定性检测。但这仍 然给科学家们留下了一个问题——如何更容易地量化扩增产物的数量，从而确定他们开始扩 增的 DNA 的数量。定量 PCR(Quantitative PCR, qPCR)的概念被提出来，即在在 PCR 反 应体系中加入荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累积，荧光信号强 度也随之等比例增加，每经过一个循环，报告一个荧光强度信号，当报告荧光信号的数量达 到一定的阈值时，可以测量相对数量的 DNA (PCR 产物)——越早达到阈值，样本的初始量 越多。这种连续的荧光测量是当今 qPCR 技术的基础，又被称为实时荧光定量 PCR(Real-time fluoroscence quantitative PCR, RT-PCR)。
初始的 RT-PCR 通过在 PCR 反应中使用能够与 DNA 结合的荧光染料，如 SYBR GREEN 染料，来实现对 PCR 过程的实时检测。SYBR GREEN 与双链 DNA(dsDNA)结合力远高 于溴化乙二胺，结合后能够释放很强的荧光信号，提高了 PCR 检测灵敏度，缩短了 PCR 实 验周期。由于 SYBR GREEN 释放的荧光信号强度与 PCR 产物数量成正比，可通过 Ct 值和 标准曲线对样品中的 DNA(或 cDNA)的起始浓度进行准确定量。20 多年来，以 SYBR GREEN 等荧光染料为基础的 RT-PCR 方法仍然是基础科学研究中最流行的选择之一，但仍 有一些问题，包括产物特异性和扩增目标的信号的不确定性。DNA 结合染料与所有双链 DNA 结合，无法区分非特异性引物退火或伪引物二聚体所产生的多个产品。为了弥补荧光染料的 缺点，在 PCR 反应中，引入了第三个寡核苷酸序列，即探针(Probe)，其上面标记了荧光 修饰基团，与目标序列特异性结合后，可在特定波长的激发光下释放出荧光信号，信号强度 与目标 DNA 成正比。由于探针只有与特异性序列结合后才能被激发出荧光信号，与 DNA 荧光染料相比，提高了荧光信号释放的特异性。
2000 年日本学者 Notomi 在《Nucleic Acids Res.》杂志上公开了环介导等温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。2009 年，日本荣研化学株式会社(以下 简称“荣研公司”)研制出 H1N1 环介导等温扩增法检测试剂盒，可通过早期快速诊断对防止 该病症的快速蔓延起到积极作用。目前，LAMP 技术具有高特异性、高灵敏度，操作简单、 对仪器设备要求低等优势，扩增结果可通过观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，已被广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速检测。
第三代数字 PCR 技术

1999 年肿瘤基因组学专家福格尔斯泰因(Bert Vogelstein)和金兹勒(Kenneth W Kinzler) 首次在美国科学院院刊 PNAS 上提出“第三代 PCR”数字 PCR(Digital PCR, dPCR)的概念， 通过将样本分充分稀释，分配到不同的 PCR 反应单元，每个单元包含≤1 个拷贝的 DNA/RNA 模板，每个反应单元内均单独进行 PCR 扩增反应，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号 进行统计学分析，以实现 DNA/RNA 绝对定量及稀有等位基因的检测。福格尔斯泰因和金 兹勒将该项技术应用于研究肿瘤罕见突变研究，并于 2003 年进一步提出基于小珠(Bead)、 乳浊液(Emulsion)、扩增(Amplification)、磁性(Magnetic)的 BEAMing 技术，将 dPCR 技术和流式技术进行结合，应用乳状液实现单个试管中实现 PCR 反应体系的分隔。
随着微流控芯片、油包水乳化液滴和纳米制造技术的发展， dPCR 的基本方法已经逐 渐建立。根据反应单元的不同分隔形式，形成了微反应室/孔板 dPCR(Chamber Digital PCR, cdPCR)、微流体 dPCR(Microfluidic Digital PCR，mdPCR)(大规模集成微流控芯片)和微 滴式 dPCR(Droplet DigitalPCR，ddPCR)三大体系。2006 年，Fluidigm 公司推出了第一台 商业化的基于芯片的商品化数字 PCR 系统——IFC 平台。该平台使用物理矩阵的策略，可 将 48 个样品逐个分布在 770 个微反应单元中。2013 年，Life technologies 推出 QuantStudio3D 数字 PCR 系统，采用高密度纳升流控芯片技术，将样本均匀分配至 20000 个单独的反应孔 中。BioRad 公司采用油包水乳化微滴技术，借助微滴发生器，将样品均分成数万个微液滴。 截至目前，美国 Thermo-Fisher 的 QuantStudio 3D 系统(cdPCR)和 Bio-Rad 的 QX200 系统 (ddPCR)占据了 dPCR 的绝大多数市场份额。

此外还有
各种PCR技术的介绍：

实时荧光PCR环介导等温扩增(LAMP)数字PCR原位PCR以及
最新PCR技术进展

其他PCR技术进展此外我还整理了
PCR实验室其他方面的知识

DNA(RNA)模板的提取和准备PCR仪校准溯源PCR 实验室的建设及质控常见问题及解答等等内容。
实在太多放不下，大家可以点个关注加个收藏慢慢品尝~~~

感恩由您

​聚合酶链反应简称PCR，是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。
PCR反应需要以双链DNA作为模板，因此最初的PCR反应用于检测目标样本的基因组中是否存在特定的目的片段，但是这种以基因组DNA为模板的PCR反应无法检测目的基因是否在样本中表达，此外由于真核生物的基因中存在内含子，直接通过基因组DNA进行PCR也很难确定样本中是否存在目的基因，针对这一问题，发展出了逆转录PCR的技术。
逆转录PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR) 是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，之后再进行PCR的过程。
1996年，实时荧光定量PCR (real-time quantitative  polymerase chain reaction，Real-time qPCR) 由美国Applied  Biosystems公司首先推出，所谓Real-time qPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。
荧光定量PCR分为绝对定量和相对定量两种：
绝对定量是用已知的标准曲线推算出某个样品中目的基因的拷贝数和浓度。
此方法所用目的基因标准品的浓度是已知的，该标准品中目的基因的量可以被精确测定，因此可将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板来进行Real-time qPCR反应，以标准品中目的基因拷贝数的对数作为横坐标，以Ct值作为纵坐标，可绘制出一条标准曲线。
对未知样品进行定量时，根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线方程中推算出样品中目的基因的拷贝数。
相对定量得到的结果为特定样本中目的基因相对于另一参照样本的量的变化。
在某些不需要对基因进行绝对定量，只需要确定基因相对表达差异的情况下，如某样品在经过某种处理后目的基因表达量是增加了还是减少了，用相对定量的方法就可以得到结果，相对定量是一种更普遍、更简单的方法。
其它PCR技术：

• RL-PCR：检测蛋白质和RNA在体内的相互作用；
  
• RNA-PCR：检测痕量RNA和低表达的基因；
  
• 反向PCR：扩增已知序列两侧的DNA；
  
• RACE：获得mRNA完整序列；
  
• LM-PCR：在模板的一端加上公共接头，这样只需知道一端的DNA序列就可以对任何DNA片段进行扩增；
  
• 重叠延伸PCR：对目的基因进行定量突变。
  

卡卡

广义说，pcr技术就一种，如果说比较有特色的可以算上荧光定量（荧光定量多了一个实时监控而已），其他的都是在这个基础上做调整。细说就多了去了，不同的调整方向，可以有不同的分类:如果没弄清楚原理，光名字就能把人绕晕