qPCR数据可用性判断及数据处理方法

生物科研实验室

一、如何判断qPCR数据是否可用？
判断依据1，Ct值在合理范围内
Ct值的定义：PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
判断依据2，溶解曲线（Dissociation curve）
Ct当然是首要看的数据值，但是紧接着就要看溶解曲线了，如果溶解曲线不对，那么Ct再好都要重来。
熔解曲线上有特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），一般通过熔解曲线判断扩增产物是否单一。
1）TM在75-90之间；
2）单峰无杂峰；
3）峰距在5个TM内最好。
1. 熔解曲线主峰前有杂峰
可能原因：存在比目的片段短的非特异性片段，也有引物二聚体的可能，此种情况下大概率需要重新设计引物了。
2. 熔解曲线主峰后有杂峰
可能原因：大多由非特异性扩增引起，存在比目的片段长的非特异性片段。可通过调整稀释倍数、减少引物等来进行调整。
判断依据3，扩增曲线（Amplification curve）
扩增曲线（Amplification curve）：随着PCR反应的进行，荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强，通过荧光强度检测扩增产物量的变化。
理想的扩增曲线是S型，有明显的四个时期
1）曲线具有平台期；
2）Fluorescence至少在3以上；
3）曲线无二次抬头。
1. 没有对数增长期的扩增曲线，无Ct值
可能原因：引物或探针降解；模板量不足或模板降解。建议试剂不要反复冻融；
2. Ct值出现过晚的扩增曲线
可能原因：扩增效率低，建议各位小伙伴可以使用核酸电泳优化反应条件，比如降低退火温度；（当ct值较大>38，本人试过在反转录时即采用特异性引物进行反转录，并加大核酸浓度，效果有所改善）
3. 扩增曲线出现向下或向上的尖峰
可能原因：反应过程中电压不稳定，也可能为卤素灯老化。
平时我们大体看前面两个依据就够了，但是qPCR跑完了，最好这三个都留意下，这三个都没有问题，qPCR可以大胆进入下一步进行计算了。
二、qPCR数据处理方法
上个讲到判断qPCR数据是否可用，Ct出来如何计算相对表达量呢？
对于qPCR数据的分析主要是绝对定量和相对定量。
1. 绝对定量主要使用标准曲线的方法；对于科研小伙伴们，主要通过相对定量来分析目的基因的表达差异。
2. 相对定量，主要使用的方法为双标曲线法和2^-△△Ct
首先要明白的就是Ct值的定义：PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
因此分析定量时目的基因Ct值取15-35较好，内参基因的Ct值一般在13-15左右较好。需要注意的是：平行孔之间Ct值相差不要超过0.5，这也是为何建议设置3个平行孔的原因。
目前计算基本上按照这个公式进行
公式=2^-ΔΔct
如果Ct值出来了，我们可以按照如下步骤一步一步来
1）求出所有样本ΔCt：目的基因Ct－内参基因Ct；
2）求出对照组ΔCt均值：使用函数 AVERAGE；
3）算出所有样本ΔΔCt: 单个样本ΔCt－对照组ΔCt均值
4）表达水平的差异倍数2^-ΔΔCt: 表格使用函数=POWER (2，-ΔΔCt)