细胞免疫荧光，看完必会！

生物科研实验室

一、免疫荧光技术


免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。



用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。



该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

二、细胞免疫荧光




主要应用于细胞内抗原抗体检测，适用于细胞水平实验。



直接法

将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。



间接法（较为常用）

如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。



操作步骤（以检测细胞内病毒抗原为例）



倒出培养液。



润洗，将1ml SD完全培养基沿培养板缓慢打入，盖上盖子，轻柔摇晃，先使用1ml的枪沿侧壁吸出润洗后，再使用200ul的枪沿壁吸出残液。



吹打，加入2ml SD完全培养基，打在培养板底部，然后反复抽打，直至培养板底部由磨玻璃样变为透明。（吹打之后放置，后使用之前都要反复吹打）



将细胞爬片放入24孔板，每孔一个（注意每个孔只放一个，不要多放，注意检查）。



往（3）中吹打后的细胞液中继续加4ml的SD完全培养基（即总计6ml）。将细胞液分装到24孔板中（分装之前吹打，防止细胞沉降而造成的不均匀），每个板500ul。注意事项：每一步打开细胞培养时，防止细胞培养板盖时勿使细胞培养板盖朝上放置。



在将细胞培养板放于培养箱之前，请喷酒精。



细胞培养24小时之内使用，最好20小时。沿侧壁吸出培养液。1PBS润洗2次，沿侧壁打入1ml或500ul PBS，轻柔摇匀2-3次后，沿侧壁吸出。



Pfu number/细胞数=pfuV/细胞数=感染复数 感染复数为2，加病毒20ul + 480ul SD培养液 感染复数为15，加病毒150ul + 480ul SD培养液 病毒滴数经提前测定为1*10-7pfu/ml



先加SD培养基再加病毒。（24h或48h之后进行（10））



固定细胞：吸出上清，加4%PFA（组织固定液），1ml/孔，室温下30min。



PBS洗2次，5min/次，1ml/孔。



细胞破膜：0.1% Triton in PBS(PBST,T为Triton) ，PBS：Triton=1L：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室温1h。



封闭：5% BSA in PBST（T:0.5%Tween）=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween)  BSA 为牛血清白蛋白。1ml/孔，室温下2h。



一抗：用封闭液按1：100（比例依照抗体说明书）稀释，300ul/孔，4摄氏度过夜。



PBST（Tween）洗3次，10min/次 。



二抗（4℃抗体荧光抗体）：用PBST（Tween）按1：1000稀释，300ul/孔，室温避光1h。



PBST（Tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） DPAI ，300ul/孔，室温避光10分钟。



PBS 洗2次，1ml/孔，立马抽出。



载玻片上滴加封片液，细胞爬片的细胞层与封片液接触。



荧光共聚焦显微镜观察。