干货分享 | 流动相pH的选择，看完这篇干货就够了！

生物科研实验室

适用范围



本思路仅适用于反向色谱法分析离子化合物方法开发中流动相pH的确定。



1、考察离子化合物的pKa值

pKa：酸式解离常数Ka的负对数

pKa越小，酸性越强；反之，酸性越弱。pKa的大小和化合物本身的结构有关，也和溶剂有关，比如在水中测到的pKa和在DMSO中测到的就不一样。

既然pKa很重要，我们怎么才能获得分析物的pKa值呢？

第一，对于已知化合物，我们可以通过一些数据库进行查询。在这里比较推荐两个开放的数据库，一个是英国RSC的www.chemspider.com，这是一个通用型的数据库，收录的化合物类型也比较广；另一个是针对于药物分子数据的加拿大数据库www.drugbank.ca，只要输入目标化合物的CAS号或者英文名，就很可能可以在这两个数据库上查到相关信息。

假如我们没办法在数据库中查到相关信息，我们可以根据一些已知数据进行预测。这就是一个比较系统的工程，因为一般一个化合物的pKa除了与它的关键基团如羧基、氨基等有关，还和这些基团所连接的其他结构有关，因此最好以结构尽量类似的已知化合物的pKa为基础进行预测。下面摘取了《Modern Physical Organic Chemistry》中常见结构的酸碱化合物在水溶液中的pKa

第二，在反相色谱分析中通常不要求化合物精确的pKa值，我们可以根据一些已知数据进行预测。对于一些典型的化学物，我们应该熟知它们的pKa。最常见的脂肪族羧酸pKa值约为5，比如布洛芬的pKa为5.2；典型的胺类化合物的pKa约为9，比如阿米替林的pKa是9.4。这样在分析一些酸碱性的问题时就可以信手拈来，方便快捷。根据化合物的结构按照下图中列出的主要酸碱官能团在水溶液的pKa值进行推测。

2、根据化合物pKa值推测流动相相应使用的pH

先看下流动相pH对酸碱化合物的影响：

1.流动相pH对不同pKa化合物的保留时间的影响

（1)调节流动相pH可改变离子化合物的保留

强酸及弱酸性化合物在酸性条件下会以分子形式存在，此时疏水性较高（极性大）在RPC的保留会较强。强碱及弱碱性化合物在碱性条件下多以分子形式存在，此时疏水性较高（极性大）在RPC的保留会较强。而中性化合物的保留基本与pH没有关系，不随pH的改变发生保留时间的变动。因此我们在方法开发的时候可以通过改变流动相的pH进行改变化合物的保留时间。

(2)如果是未知的化合物，调节pH值我们可以根据保留时间的变化推断化合物的酸碱性，比如保留时间随着pH的增大而延长的样品肯定是碱性化合物。

2.流动相pH对化合物峰型的影响

根据流动相pH对酸碱化合物的电离的影响，当化合物的pKa与流动相pH重合时会导至分子与离子形式共存，化合物的峰型不好。因此建议将pH控制在化合物的pKa±2的范围以外，此时化合物99%基本是以分子或者离子形式存在，峰型会更加的尖锐。

3.流动相pH对化合物的选择性的影响

当流动相的pH约等于化合物的pKa时，可以最大限度的调整化合物的保留时间。此时改变0.1个单位的pH可以使得保留因子k变化10%，可引起分离度±2.5个单位的变动。但此时需要进行精确控制流动相的pH，这要求把流动相pH控制在0.02个单位以内，在实验室很难控制，重现性较差，成为分析的瓶颈。

通过以上三点分析我们可以得出，待分析化合物的pKa与确定流动相的pH有很大的关系。主要依据化合物出峰时间、化合物的峰型及所需要分离目标的化合物综合考虑来确定流动相的pH。

可能有的同事会发现第二点和第三点是有些矛盾的，这时候就需要对自己的实验进行初步的探索，看看是否pH值会对化合物的峰型产生影响（有的专家认为该观点缺乏理论和实践的支持）或者是否需要准确调节pH在化合物pKa±1.5范围内进行提高选择性。

笔者在做实验时发现有的物质会因稀释液pH使用不当产生峰分叉的现象，调节稀释液的pH即可解决峰的分叉；有时流动相pH在化合物的pKa±2的范围内时离子化合物并没有出现峰分叉、峰型不好现象。