超氧化物自由基（O2•-) 检测

生物科研实验室

提到超氧化物 (O2•-)，就得先聊聊荧光探针   Dihydroethidium (DHE，又称 Hydroethidine, HE, HY-D0079)！其主要检测 O2•-。由于 O2•- 通常是占比最高的 ROS 成分，DHE 也被广泛用于 ROS 的检测。未氧化形式下，DHE 产生固有的蓝色荧光 (Ex/Em=370/420 nm)，当 DHE 被 O2 氧化时，产生了一种荧光化合物乙锭 (E+)，可嵌入 DNA 的双螺旋结构中，形成乙锭-DNA 复合物，产生红色荧光[1][7]。
实验步骤[7]
1. 溶液配制（1）制备储存液
用无水 DMSO 配制 10 mM 的 DHE 储备液 (1mg DHE 溶于0.317 mL DMSO 中)。（2）工作液的配置用预热好的无血清细胞培养基或 PBS 稀释储存液，配制成 1-10 μM 的 DHE 工作液（请根据实际情况调整 DHE 工作液的浓度）。2. 细胞染色 (悬浮细胞)（1）1000 g 离心 3-5 分钟，弃上清。PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。（2）加入 1 mL Dihydroethidium 工作液，室温孵育 30 分钟。（3）4℃，400 g 离心 3-4 分钟，弃上清。（4）PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。（5）用无血清细胞培养基或 PBS 重悬细胞，荧光显微镜或流式细胞仪检测。3. 细胞染色 (贴壁细胞)（1）将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。（2）从培养基中移出盖玻片，吸除多余培养基。（3）加入 100 μL 染料工作液，轻轻晃动使其完全覆盖细胞，孵育 30 分钟。（4）吸去染料工作液，用培养基洗 2-3 次，每次 5 分钟 ，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察（若需要用流式细胞仪检测，需将细胞用胰蛋白酶消化重悬后再进行染色）。