核酸恒温扩增技术研究

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]核酸检测技术近年来发展迅猛，尤其是在分子诊断POCT领域。目前市场上主要的POCT核酸检测技术为qPCR核酸检测技术，特异性强，灵敏度高，可以定量对病原体进行检测，并很好的实现高通量检测，但热循环过程需要热循环仪。热循环仪体积大、价格较高，时间也相对较长，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。恒温扩增核酸检测技术由于其检测快速、价格低廉等优势，而在及时现场检测市场中脱颖而出。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]2019年末将近时，面对突如其来的新型冠状病毒肺炎，核酸检测被广泛提及。作为IVD领域主要的的检测方式之一，核酸检测利用核酸扩增技术、核酸测序技术、基因编辑技术和分子杂交技术，能够快速对患者生物样本中的核酸进行检测，为感染病例确诊提供医学检验证据。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]病原体检测是目前临床上核酸检测应用最广的领域，主要包括乙型肝炎、丙型肝炎、寨卡病毒、艾滋病、人乳头瘤病毒等。除病原体检测外，核酸检测还被用于肿瘤基因检测、遗传病检测、产前筛查等多个领域。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]核酸检测技术经过几十年的发展，已经形成了较为完善的技术体系。2019年全球核酸检测市场规模达到85亿美元，中国为106亿人民币，中国占全球市场规模的18%，每年以超过15%的速度实现增长，2025年有望达260亿元，成为全球最具潜力的市场。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]核酸检测的使用者包括医院检验科、第三方医学检验中心、体检机构、疾病防疫中心、血站，根据《卫生计生委关于促进单采血浆站健康发展的意见》，2019年底实现单采血浆站核酸检测全覆盖。而目前全国共设置血液中心32个，中心血站321个，中心血库99个，按照年检测量每8-10万人份配置1套核酸检测系统，这将为核酸检测仪器创造广阔的市场空间。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]近年来，在核酸检测细分领域中，分子诊断POCT产品正在不断增多，其中两大技术流派的产品备受关注：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]一个流派是采用qPCR技术进行检测的分子诊断POCT产品，目前市场总额为36亿美元，2024年市场总额预计达到54亿美元（如图1所示）。目前很多公司都已开发出了成熟的产品，使qPCR技术取代传统PCR成为核酸检测的主流。以这次新冠病毒的检测为例，中国迄今为止批准了19个紧急授权使用的试剂检测产品，其中核酸检测试剂11个，抗体检测试剂8个。而核酸检测中的9种是qPCR技术；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]另一个流派是采用恒温扩增技术进行检测的分子诊断POCT产品，市面上这类产品并不是非常多，但恒温扩增技术的优势正逐渐取代qPCR技术，已经在临床医学、检验医学、分子生物学、水和食品安全等不同领域中的发挥着重要作用，特别是在致病菌、病毒等传染微生物的检测中。2019年恒温核酸扩增技术的市场总额为19亿美元，2024年其市场总额预计达到33亿美元（如图1所示），有望实现11.1%复合增长率。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图1 qPCR与恒温核酸扩增技术的市场及增长率比较（源自药时代）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]qPCR特异性强，灵敏度高，可以定量对病原体进行检测，并很好的实现高通量检测，但热循环过程需要热循环仪。热循环仪体积大、价格较高，时间也相对较长，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。20世纪90年代初，研究人员尝试创新开发无须热变性的恒温核酸扩增技术。恒温扩增技术的基本原理和反应成分各不相同，但本质上要解决的核心难题是使新合成的DNA模板在恒定的温度下退火变性进而引发进一步的扩增反应，这使得恒温扩增技术具备检测快速、价格低廉等优势 (如表1所示) ，而在及时现场检测（point of care）市场中脱颖而出。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]表1 不同核酸分子诊断技术的优劣势比较

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]恒温扩增技术可以分成两类，第一类是扩增反应依赖于特异性引物延伸；第二类是扩增反应依赖于限制性内切酶。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]第一类扩增反应依赖于特异性引物延伸包括：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]①1991年由Compton等提出的依赖核酸序列扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA），主要依赖AMV逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶和一对引物来完成等温扩增；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]②Fire等于1995年首次提出借鉴微生物环状DNA复制过程的滚环扩增技术（Rolling circle amplification，RCA）。在RCA反应中，phi29 DNA聚合酶是至关重要的组成部分，具有持续DNA合成能力和链置换活性；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]③Notomi等于2000年开发环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。LAMP使用4条引物，特异性强、灵敏度高、检测下限可达几个拷贝；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]④Wharam等于2001年创建了依赖RNA转录信号介导的RNA扩增技术（Signal-mediated amplification of RNA technology，SMART）。SMART不是通过增加靶序列拷贝数实现检测，而是通过信号的放大来进行；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑤Vincent等于2004年提出的模拟动物体内DNA复制机制的依赖解旋酶扩增技术（Helicase-dependent amplification，HDA）；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑥Kurn等于2005年首次报道单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification，SPIA）。该技术主要通过使用一条嵌合引物 “5′-RNA-DNA-3′”、RNase H和具有强链置换活性的DNA聚合酶来实现核酸等温扩增；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑦Piepenburg等参照了T4噬菌体DNA复制系统于2006年创建了一种新型的等温扩增技术，使用酶来打开双链DNA，该技术称为重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑧随后发明的酶促重组等温扩增技术（ Enzymatic Recombinase Amplification，ERA）技术原理与RPA相似，不同之处在于ERA的重组酶来源于细菌，病毒和噬菌体，而RPA的重组酶来自T4噬菌体；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑨实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，SAT）是我国上海仁度生物科技有限公司于2008年将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑩交叉引物扩增技术（Crossing Priming Amplification，CPA）是我国杭州优思达生物公司于2008年自主研发的一种等温扩增技术，可利用3对引物 （两条交叉引物、两条剥离引物和两条探针）、Bst DNA 聚合酶等得到大量重复带有交叉位点的扩增产物。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]第二类扩增反应依赖于限制性内切酶包括：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]①Walke团队于1992年首次报道的置换扩增技术（Strand displacement ampli-fication，SDA），此方法的建立标志着一种新型DNA扩增技术的诞生。SDA反应全过程主要依赖于限制性内切酶对半硫代磷酸化碱基对应互补链的切割作用，以及聚合酶exo-klenow对切口的延伸作用和对下游DNA片段的置换作用；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]②Van Ness等于2003年开发了指数扩增反应（Exponential amplification reaction，EXPAR）。该技术利用扩增模板合成寡核苷酸，长度为8-16 mer。反应试剂中的BstNBI切口酶在反应中发挥着至关重要的作用，因此，也可以把该技术称为切口酶扩增反应（Nicking enzyme amplification，NEAR）；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]③2006年研发切刻内切酶介导等温核酸扩增技术（Nicking enzyme mediated amplification，NEMA）。NEMA反应体系中使用一种能够识别特异性的位点并发生自然单链切割产生缺口的切刻内切酶。切刻内切酶的使用克服了传统SDA反应中需要添加化学修饰的非标准核苷酸的缺陷，简化了反应体系，提高了反应效率，成本更低，并且可合成长链DNA。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]qPCR技术大同小异，而恒温核酸扩增技术实现的方式却各不相同（如表2所示）。那么谁是更好的恒温核酸扩增技术呢？现在还是群雄战国时代，尚无法下结论，只能从它们的市场表现来发现些许倪端。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]表2 不同恒温核酸扩增技术比较

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]各恒温扩增技术市场表现如图2所示：2016年TMA和LAMP各占约15%的市场份额，NEAR（EXPAR）占9%份额，其它的技术也各有一席之地。到2018年，NEAR发展最快，市场份额接近三分之一。LAMP技术市场份额位居第二。而TMA技术市场份额下降明显。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图2 不同恒温核酸扩增技术市场份额比较 （源自药时代）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]恒温扩增技术国际市场相对固化且竞争激烈，主要的五家巨头及其采用的恒温扩增技术原理包括：Becton Dickinson and Company（采用SDA技术）、Qiagen NV（采用RCA技术）、BioMerieux SA（采用NASBA技术）、Quidel Corporation（采用HDA技术）、以及Tecan Genomics（采用SPIA技术）（详见图3）。此外，在新冠疫情形势下，雅培公司采用NEAR技术研制的ID NOW检测试剂盒迅速吸引人们视线。国内的一些公司也迅速发展起来，其中典型代表为博奥生物和百康芯（均采用LAMP技术）、苏州先达基因科技有限公司（ERA技术）、上海仁度生物科技有限公司（采用SAT技术）、以及杭州优思达公司（采用CPA技术）。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图3 恒温核酸扩增技术国际市场主要竞争对手及其采用的技术原理

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]为了更好地有选择地开发利用这方面技术，本行业研究现重点就应用最广泛最有前景的LAMP、NEAR、SDA、NASBA、RCA、HDA、SPIA、RPA、ERA、SAT、以及CPA技术的原理、发展历史、优缺点、相关产品及应用进行详细介绍。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]1、环介导恒温扩增技术（LAMP）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]1.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]环介导恒温扩增技术是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，它针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物（包括2条内引物和2条外引物），利用一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，其反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。其基本原理（如图4所示）是靶DNA变性后，内外引物在Bst DNA聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA，然后进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图4 LAMP引物设计和反应原理

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]1.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]LAMP的优点包括：①LAMP有较高的特异性和抗干扰能力，只有当2对引物与目的片段的6个区域都匹配上时才能进行扩增；②LAMP的反应体系稳定可靠，在室温下放置2周后仍然稳定，并且对于样品中原有或污染的无关、干扰片段依然不敏感，而其他类似技术则无法做到这一点；③LAMP的敏感性较高，扩增快速、高效；④LAMP结果的鉴别很简便，用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能判断扩增与否。因此，只要引物设计正确，并且完善各种反应条件，LAMP对于样品处理、操作技术和仪器设备的要求都比较低，在野外工作时也能达到。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]LAMP的缺点包括：①由于LAMP扩增时链置换合成，靶序列长度最好在300bp以内，大于500bp则较难扩增，故不能进行长链DNA的扩增；②由于其灵敏度高，操作过程中极易受到污染而产生假阳性结果，故实验过程中要特别注意严谨操作；③其在产物的回收、鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统PCR方法。④虽然LAMP仪器更简单更便宜,但LAMP的引物设计难度高，试剂成本会相应高于qPCR；⑤LAMP技术较难多重扩增；⑥LAMP技术只能定性，不适合定量。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]1.3 相关产品及应用

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]LAMP在应用于检测各种病原体的同时，现已逐步用于包括DNA病毒、RNA病毒、细菌和寄生虫等的定性和定量检测，如对新冠病毒、HIV病毒、流感病毒、埃博拉病、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒、副溶血弧菌和日本血吸虫伪蚴等的检测，也可用于转基因食品的检测及动物胚胎性别鉴别等。市场上可供购买的主要的LAMP相关产品如下：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]其他

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]Loopamp TB检测试剂盒，布氏锥虫试剂盒，单核细胞增生李斯特菌检测试剂盒，用于环境检测的军团菌筛选试剂盒E，疟疾试剂盒，SARS冠状病毒检测试剂盒，弯曲杆菌检测试剂盒，肺炎支原体检测试剂盒，大肠杆菌O157检测试剂盒，隐孢子虫检测试剂盒和牛胚胎性别分型试剂盒目前均可从Eiken Chemical Co.，Ltd获得。2010年，Meridian Bioscience USA开发了另一种用于检测C.difficile的LAMP检测方法，称为illumigene® C. difficile。由于它的高灵敏度，产品一上市就颇受欢迎（Pancholi等，2012）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]2、切口酶恒温扩增反应技术（NEAR）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]2.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]切刻内切酶（NEAR）恒温扩增是目前相关研究最少的一种恒温核酸扩增技术。它是在2008年由Ionian科技公司的研究人员开发并申请专利的（Brain等2009）。Ionian是加州的初创公司，成立于2000年，在2010年被Alere收购。而后Alere在2017年被雅培收购，NEAR成为雅培的专利。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]NEAR是一种链置换放大技术，其原理是在核酸切刻内切酶切刻形成的裂口处，通过聚合酶的作用以dNTPs为原料从裂口处的3’端聚合延伸，置换出等位的DNA链，由此又形成了新的完整的含有切刻酶识别位点的DNA序列。这条双链再次被核酸切刻内切酶识别切割，进而开始“聚合-切刻”的循环，产生大量被置换下来的DNA单链，形成指数级扩增。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图5 NEAR反应原理

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]2.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]NEAR的优点：①速度快（最快5分钟可以得到阳性结果）；②灵敏度高（初始只需要数百个病毒拷贝）；③区别于引物设计较复杂的LAMP技术，NEAR技术反应形式多样，可满足不同的扩增需求；④反应稳定性好

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]NEAR的缺点：①短序列的设计存在高假阳性的可能；②仪器的通量很小，一次只能检测一个样本；③反应机制复杂、产物产量易受扩增模板限制，使得后期扩增从指数增长变为线性增长；④检测的重复性略低于qPCR；⑤NEAR恒温扩增技术的特异性与灵敏度依赖于分子信标引物和Nicking酶，分子信标引物的设计难度大，Nicking酶与其他恒温扩增酶一般都普遍比传统的实时荧光PCR酶要贵，故在检测成本和应用范围等方面，NEAR恒温扩增技术逊于qPCR。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]3、链替代扩增技术（SDA）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]3.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]链替代扩增技术 (SDA) 是美国学者Walker等于1992年首次提出的一种基于酶促反应的新的DNA体外等温扩增技术。其基本系统包括1种限制性核酸内切酶、1种具有链置换活性的DNA聚合酶、2对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。如图7所示，其反应基本过程包括单链DNA模板的准备、两端带酶切位点的目的DNA片段的生成、SDA循环等3个阶段。其基本原理是：引物与靶DNA序列上对应的DNA单链杂交（退火），在聚合酶作用下产生带Hinc II识别位点含5’和3’端的靶DNA序列，该靶序列进入SDA循环；Hinc II限制性核酸内切酶切割识别位点，依赖具有链置换活性的DNA聚合酶在切割处延伸3’端，并替代另一条DNA链；该替代链与引物杂交后又依次作为另一扩增反应的靶源，这些步骤在反应体系中不断重复，使靶DNA序列呈指数性增长；37℃-40℃进行23次循环后，2h内靶序列可能得到10^8扩增。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图7 SDA反应原理图

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]3.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]SDA的优点：SDA提供了一种可用于核酸诊断分析的扩增方法，无须温度的变化。其显著优点是灵敏性高，可快速扩增获得单链DNA分子。与其他DNA扩增技术相比，SDA具有快速、高效、特异的优点，且无须专用设备。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]SDA的缺点：①在SDA中为了建立一个可用于扩增的缺口，必须在反应混合物中加入非标准核苷酸，这样不仅增加了反应的成本，而且使扩增效率降低；②由于SDA产物的两端必然带有所有核酸内切酶的识别序列及其残端，因而SDA产物也不适合直接用于克隆，这使得其在基因工程方面没有优势；③SDA在等温扩增之前需要一个加热变性打开双链的步骤，由于exo-Klenow无热稳定性，必须在靶DNA变性后才能加入体系中，容易引起污染；④SDA产物不均一，由于在SDA循环中总要产生一些不同的单、双链产物，这使得电泳检测SDA扩增产物时必然要出现拖尾现象；⑤SDA产物目前检测的主导方法是荧光偏振检测法，需要特殊的仪器荧光分光光度计，这就限制了SDA在临床的广泛应用。此外，SDA可能因标本中含有不明抑制物，使检测不能反映标本中靶DNA的真实含量。复合DNA中高含量DNA对低含量靶DNA的竞争抑制也很常见。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]3.3 相关产品及应用

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]目前SDA除已用于分枝杆菌DNA序列的检测外，在细菌检测、建立体外进行模型、病毒载量监测、核酸定量及芯片杂交等多个方面也有应用。Little等将SDA与荧光共振能量转移技术相结合，发明了新一代DNA探针系统，以及BD (Becton,Dickinson and Company) Probe Tec ET系统，可以用来检测沙眼衣原体、淋球菌等。Mehrpouyan等用SDA检测HIV-1 RNA获得成功，这说明SDA可用于所有核酸的检测。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]4、依赖核酸序列的扩增 （NASBA）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]4.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]依赖核酸序列的扩增技术 (NASBA) 是1991年由加拿大 Can-gene 公司首次介绍。它是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程。如图8所示，整个反应由非循环相和循环相组成: 首先进行非循环相，在AMV逆转录酶的作用下，引物I与模板RNA退火后合成cDNA，形成RNA/DNA杂合体，随即RNaseH降解RNA，引物Ⅱ与cDNA退火，合成第二条DNA互补链。形成的DNA双链由T7 RNA聚合酶识别启动子序列，催化合成RNA，进入循环相，对模板进行大量扩增。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图8. NASBA反应原理图

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]4.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]NASBA的优点：①反应条件温和，且反应时间比PCR短，因此转录更加忠实于模板，错配率很低，因而特异性更强；②反应迅速；③NASBA反应产物是单链RNA，因而可采用杂交监测系统来提高该技术的敏感性和特异性；④操作简单；⑤适用检测样品的范围广。在有DNA污染或存在的条件下，NASBA技术同样具有较高的特异性和灵敏度。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]NASBA的缺点：①早期版本对部分亚型 (G亚型) 反应差；②操作复杂，样品提取 (不使用自动提取仪时)和测定反应时需要大量手工操作；③不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测；④实验内、外误差相对较大。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]4.3 相关产品及应用

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]NASBA作为一项检测技术是十分成熟的，并且已经在国际上受到基础科学和应用科学研究领域的一致认可。目前主要用于RNA的扩增、检测及测序，特别适用于扩增单链RNA，也可用于扩增DNA，已成功地应用于病毒、细菌、寄生虫和细胞因子等的检测。在动物医学方面，已经广泛用于禽流感病毒、新城疫病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒和产单核细胞李斯特菌的检测和研究中。Biomeriex公司的恒温扩增产品便是采用这种方法设计的。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]5、滚环扩增技术（RCA）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]5.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]1998 年建立的滚环扩增 (RCA) 是模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，发展起来的一种放大信号和靶核酸相结合的检测方法。如图9所示，在恒定温度下以单链环状DNA为模板，在有强链置换活性的φ29 DNA聚合酶的作用下，通过引物与模板环退火而进行滚环式DNA合成。RCA包括线性扩增与指数扩增等2种形式。线性RCA是引物与环状DNA杂交结合后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量与环状DNA互补的重复序列的线形DNA单链。指数RCA原理与线性RCA相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板参与反应，因此使得产物在很短的时间内呈指数递增。指数RCA也可用于非环状DNA的扩增。设计一引物，其两端可结合到一段连续的序列上，并形成缺口，在连接酶的作用下，引物被连接成环状，此环状引物可作为RCA的模板进行指数扩增。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图9 RCA反应原理图

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]5.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]RCA的优点：①高灵敏度。RCA有很强的扩增能力，线性RCA的效率可达到10^5倍，而指数RCA的效率可达到10^9倍，这一高灵敏度特性使其能够检测到单拷贝水平；②高序列特异性。可以区分单一位点的不同模式；③扩增产物经过磷酸化处理后可以直接用来测序；④高通量。RCA可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增；⑤RCA只要保证探针的识别段序列和靶序列互补，不需要考虑靶序列的性质，因此检测RNA时不再需要预先进行RNA的逆转录。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]RCA的缺点：①线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]6、依赖解旋酶的恒温基因扩增（HDA）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]6.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]依赖解旋酶的恒温基因扩增是美国New England Biolabs的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制，发明的一种体外恒温基因扩增技术。如图10所示，先用解旋酶解开双链DNA，再依靠单链DNA结合蛋白 (SSB) 与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性，引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶催化下扩增，新生成的双链DNA产物作为底物进入下一轮扩增。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图10 HDA反应原理图

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]6.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]HDA的优点：①与其他恒温基因扩增技术相比，HDA更简单有效；②HDA反应体系仅需2条引物，且设计简单；③HDA扩增用时75-90min，操作简便，不需要昂贵的PCR仪，较细菌学、免疫学和PCR方法更适于在基层实验室推广应用。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]HDA的缺点：HDA的研究者较少，发展还不够成熟。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]7、单引物等温扩增技术（SPIA）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]7.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]单引物等温扩增技术由Kurn等于2005年首次报道。该技术的核心是一条混合引物及可以切割DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶，由3'端DNA部分和5'端RNA部分组成。如图11所示，在反应过程中，RNaseH不断降解引物区DNA/RNA双链中的RNA部分，暴露出模板上与引物RNA部分结合的位点，然后新引物结合上去进行链置换合成，经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图11 SPIA反应原理图

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]7.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]SPIA的优点：①使用单引物，减少了引物二聚体的形成；②不受RNA干扰；③反应机制简单，效率高。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]SPIA的缺点：①模板是单链核酸，需要双链核酸进行热变性处理；②需对blocker进行碱基修饰，提高扩增成本；③引物设计较复杂。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]7.3 相关产品及应用

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]目前SPIA技术已被用于表达分析以及病原菌检测，同时该技术被证明在检测沙门氏菌方面比qPCR具有更好的灵敏性和特异性。Tecan Genomics的恒温扩增产品便是采用SPIA原理设计的。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]8、重组酶聚合酶扩增（RPA）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]8.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]RPA技术是2006年英国TwistDx公司通过突破等温DNA扩增，开发的重组酶聚合酶扩增专利技术（RPA），TwistDx于2010年被Alere收购。之后在2017年雅培通过收购Alere获得可RPA技术的专利。RPA技术被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶: 能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件（见图12）。（Piepenburg等，2006）

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图12 RPA反应过程和重组酶和引物复合物的形成

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]重组酶/引物复合物寻找模板DNA的同源序列（红色/蓝色）。链交换后，置换的链由gp32（绿色）结合，引物通过Bst聚合酶（蓝色）延伸。两个引物结合/延伸最终产生一个完整的扩增拷贝。重复该过程导DNA指数扩增。（Piepenburg等，2006）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]8.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]RPA的优点：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]①快速检测，在 37-42°C 这一通常最适宜的反应温度下，只需少量核酸分子即可在 3-10 分钟（通常）内扩增至可检出水平，但这将取决于靶标大小。在大部分情况下，只需要一个人即可在半小时内采集样本、制备样本、运行检测并取得结果，并且无需专业培训；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]②支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量（nmol）最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光物质的兼容性都需要提前考虑；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]③可定量。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]④25-42℃常温反应，无须热循环，摆脱任何仪器束缚；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑤可进行荧光终点分析；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑥引物设计简单，PCR引物设计软件可进行，只要将长度增加到30bp以上，更能保证其特异性；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑦灵敏度高，能将痕量的核酸模板（1-10拷贝）扩增到可以检出的水平；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]⑧特异性高，与qPCR无差异，特别适合微量样品的检测。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]此外，RPA相较于LAMP具体优点如表3所示：在反应温度方面，RPA在37℃下即可进行，无需任何仪器，而LAMP需在60-65℃条件下进行。在反应时间方面，相较于LAMP的40min，RPA仅需15min就可完成。并且RPA只需1对引物，试剂呈冻干状态。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]表3 RPA与LAMP技术比较

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]RPA的缺点：①琼脂糖凝胶电泳成像在检测前需要产物纯化；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]②没有PCR的热循环来避免引物之间的结合，故恒定温度下反应难以避免部分非特异性扩增。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]8.3 相关产品及应用

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]目前，RPA在国际上已有3个公司分别各有1项类似技术，其中主要是被雅培收购的TwistDx的核酸扩增产品。以RPA为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]9、酶促重组等温核酸扩增技术（ERA）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]9.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]相比于RPA，ERA是最新型的体外恒温扩增技术，与RPA原理基本相似，然而RPA的重组酶来自T4噬菌体，ERA重组酶来源于细菌，病毒和噬菌体。ERA在37-42℃下反应15-30min可得到与传统高温PCR相同的目的片段。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]9.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]由于ERA原理与RPA基本相似，因此具备相似的技术优缺点。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]9.3 相关产品及应用

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]在国内，ERA技术已经申报了专利（苏州先达基因科技有限公司），基于此平台开发了多系列的核酸诊断试剂及其配套的便携式检测设备；产品涵盖食品安全快速检测、畜牧水产快速检测、体外分子诊断、POCT诊断试剂盒等领域。由于ERA和ERA在温度需求上更接近于所谓的等温扩增，也是未来核酸检测方面最有望大力发展和推广应用的等温技术。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]苏州先达基因科技有限公司ERA技术及产品

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]ERA技术应用领域，1、研究诊断领域：针对细胞培养中的支原体污染，提供一种快速、简单、灵敏的检测方法，只需要20分钟便能得出结果

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]2、公共卫生领域：针对危害公众健康的呼吸道传染性病原，肠道致病病原及生殖系统病原进行快速检测

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]3、食品安全领域：针对致病微生物、动物源性成分和转基因农产品进行快速现场检测

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]4、农业生产领域：针对水产、畜牧养殖和宠物中各类病原，进行早期快速检测和诊断

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]产品包括：RT-荧光型核酸扩增试剂（ERA法）、RT-基础型核酸扩增试剂（ERA法）、RT-试纸型核酸扩增试剂盒、荧光型核酸扩增试剂（ERA法）、基础型核酸扩增试剂（ERA法）、以及试纸型核酸扩增试剂盒。具有可检测性、灵敏性、快速性以及特异性等优点，反应组分已经混合好并冷冻干燥成干粉状态，操作简便，易于保存。要求引物大小在30-35bp 范围之内，以保证扩增反应的有效性。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]先达基因荧光恒温扩增仪

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]先达基因的荧光恒温扩增仪GS8可实现恒温扩增与荧光信号检测于一体。在恒定温度条件下，可对核酸特异基因进行扩增及定性检测，通过实时荧光扩增曲线，在20分钟内即可判断样品中是否含有特异基因，检测过程无需开盖，避免气溶胶的产生，结果可靠性大幅度提高。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]10、实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]10.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]RNA 恒温扩增技术(Simultaneous Amplification and Testing，SAT) 为我国上海仁度生物科技有限公司于2008年自主创新的RNA检测技术，是目前CFDA批准的唯一的核酸恒温放大实时荧光检测技术产品，拥有两项核心发明专利技术（Simultaneous Amplification and Testing, 中国专利号：200810111479.0；特异磁珠法，中国专利号：200810111479.0）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]RNA 恒温扩增技术的基本原理如下（如图13所示）：①SAT技术以rRNA为靶标，在M-MLV反转录酶作用下产生一条cDNA链; ②M-MLV 反转录酶的RNaseH酶活性将杂合的RNA/DNA中RNA降解，再经M-MLV反转录酶作用产生一个cDNA拷贝; ③随后T7RNA多聚酶以反转录的DNA为模板扩增产生100-1000个RNA拷贝；④每一个RNA拷贝从反转录开始再一次进入扩增循环，同时扩增产生的RNA 拷贝与优化的探针特异结合产生荧光信号；⑤由荧光检测仪捕获荧光信号进行分析。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图13 SAT反应原理图

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]10.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]SAT的优点（如表4所示）：①检测靶标为RNA，灵敏度高。可区分潜伏性和活动性感染，可区分死菌、活菌、辅助判愈；②磁珠捕获，可去除各种抑制剂，反应不易受抑制，实现尿液检测；③扩增产物为RNA，不易污染；④42℃恒温扩增，检测速度快，扩增检测过程只需40min，可实现自动化高通量检测。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]表4 SAT与其他临床常用检测方法比较

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]11、交叉引物扩增技术（CPA）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]11.1 原理和发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]交叉引物扩增技术（CPA）是杭州优思达生物公司于2008年自主研发的一种等温扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。根据交叉引物数量的不同，CPA可分为双交叉扩增和单交叉扩增。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]双交叉引物扩增包括3对引物 （两条交叉引物、两条剥离引物和两条探针）、Bst DNA 聚合酶、甜菜碱及其他必要成分。正向交叉引物中的1s与模板互补序列结合，在链置换 DNA 聚合酶的作用下完成延伸，剥离引物 3s 将合成的DNA单链置换下来，反向交叉引物2a与其结合并延伸，经剥离引物4a置换，即可产生带有交叉引物位点的扩增产物。以带有交叉引物位点的扩增产物为模板，通过交叉引物和 DNA 聚合酶的循环杂交、延伸，就可得到大量重复带有交叉位点的扩增产物。其原理见图14。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图14 CPA的双交叉原理图

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]单交叉引物扩增体系中只有一条交叉引物，首先交叉引物中的 1s 与模板互补序列结合延伸，剥离引物4s置换出新合成的单链，将 2a 引入到扩增产物中，在链置换 DNA 聚合酶作用下，以新合成的单链为模板，引入特异引物 3a、2a，得到两条不同的单链DNA。2a和交叉引物分别与单链DNA产物迅速结合并延伸，形成两条不同长度的产物。以此产物为模板，引物1s或3a、2a与其结合、延伸，不断循环杂交，最终得到大量扩增产物。其原理见图15。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]图15 CPA的单交叉原理图 图15 CPA的单交叉原理图

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]11.2 技术优缺点

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]CPA的优点：操作简单，在水浴锅内63°C左右条件下1h即可得到大量产物，结合胶金试纸条技术可快速得到检测结果。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]CPA的缺点:反应体系复杂，方法不稳定，有假阳性现象。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]12、总结

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]和传统的PCR技术相比，恒温扩增技术不仅仅是缩短了核酸扩增的时间，更重要的是恒温核酸扩增摆脱了对硬件的束缚，大大降低了价格成本，在基层的推广和现场检测中显示了其非常好的应用前景，这些都是恒温核酸扩增技术在分子诊断领域迅猛发展的必要因素。另一方面，恒温核酸扩增技术与qPCR技术有着很强的技术互补性，即使恒温核酸扩增技术的年复增长率比qPCR高，但并不能取代后者。qPCR的优势在于中心实验室的高通量测试，而恒温核酸技术更擅长即时快速现场检测（point of care）。二者的互补性多于竞争性。此外，恒温扩增技术平台的稳定性不如qPCR，未来需要更多的研发投入，怎样使恒温扩增平台技术更加稳定，是恒温扩增迫切需要攻破的技术难关。

黄先生

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