基于ERA技术的 CRISPR/Cas12a-assisted快速鉴定啤酒腐败菌

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啤酒浑浊、风味异变或酸败主要是由于微生物中的腐败菌、病菌捣乱的结果。一经腐败菌和病菌光顾，不消几天甚至几小时，就会变酸变质，毒素 滋生 ，人们误食了就会中毒生病，严重的还会危及生命。啤酒腐败细菌检测方法有多种，广泛使用的传统微生物培养方法是耗时的，只允许回顾性监测。免疫学的检测方法适用于啤酒酿造过程的各个阶段的样品，其专一、简便、易于自动化的特点预示其有较好的发展前景，但需要降低单克隆抗体的制备成本。经典的检测手段是逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。然而RT-PCR需要使用昂贵的实时荧光定量PCR仪器，同时需要专业人士操作，尚不是一种现场检测技术。而基于抗体的现场检测手段，特异性和灵敏度一般不及核酸检测方法，同时发展出高效价的抗体也需要数周乃至数月的时间，难以实现应急检测。

而在近日，国内众多研究所专家在欧洲食品科学与技术联合会（EFFoST）官方科学期刊刊登了快速鉴定啤酒腐败细菌课题研究中取得突破性成果，通过由先达基因研发的酶促恒温扩增技术（ERA技术），实现了对腐败菌现场的准确快速核酸检测。

研究内容

在本研究中，专家建立了一种快速、特异且高度便携的基于 CRISPR/Cas12a 的关键啤酒腐败细菌扫描方法，称为 CRISPR-Beer Scan。以这些主要腐败微生物物种的可变 16SrDNA片段为目标，确定了高效和特异的crRNA。用ERA恒温扩增的方式，搭配合适探针，CRISPR-Beer Scan可以检测低至10个拷贝的DNA目标。可以在啤酒中调节的基因组DNA混合物中准确识别痕量的目标基因组DNA。此外，提取的基因组DNA样本可以通过CRISPR-Beer扫描方法在45分钟内通过蓝光激发的视觉荧光信号方便地进行区分。

研究特色

1、对crRNA靶标的16SrRNA区域的确定。使用在线工具对该区域的序列及其侧翼序列进行了设计，进一步选择每个物种的3个crRNA，以靶向具有高度种内保守和种间/种间变异的序列。

2、所设计的crRNA的有效性和特异性检测。制备了重组的Cas12a蛋白和不同的crRNA，针对每种细菌的两种crRNA通过了最初的测试。为了提高检测灵敏度，这两种物种特异性的crRNA随后被组合在每个cas12a依赖的检测反应中。

3、等温ERA与CRISPR/Cas12a相结合，可以敏感地检测到微量的 DNA。足够数量的底物DNA是CRISPR/Cas12a检测系统可测量读出的关键。因此，一个高效的目标序列预扩增步骤可以显著提高整体检测灵敏度。酶促恒温扩增技术(ERA)是一种等温扩增方法，具有高灵敏度、快速动力学和对复杂反应环境的良好耐受性。它已被广泛用于细菌、病原体和病毒的检测。为了确保目标的充分预扩增，为每个目标物种设计了两个正向和两个反向引物。将这些正向和反向引物分别组合成4对不同的引物，在ERA反应中预扩增目标。然后通过相应的CRISPR/Cas12a检测，确定最有利的扩增引物对。

4、CRISPR/Cas12a辅助检测系统从啤酒腐败细菌中鉴定出基因组DNA。为了测试更复杂的样本，混合了不同的细菌基因组DNA组合。数据表明，即使与其他物种的DNA混合，也可以特异性识别啤酒腐败细菌的DNA。

5、通过荧光，可以识别出CRISPR/cas12a辅助细菌检测的荧光读数。报告基因中485nm蓝光激发的FAM组发出可见的、明亮的绿色光，用细菌DNA测试了这种方法。结果表明，这种方法将更兼容现场检测。

6、实现了现场乃至居家检测，通过简单的蓝白光成像仪乃至蓝光手电筒可以通过荧光进行便捷检测。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ifset.2021.102854

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