快速核酸检测系统介绍--CRISPR

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背景基因编辑“大咖“张锋博士领衔的团队，最大的贡献之一是研究发现CRISPR_Cas9可以在gRNA引导下特异性切割DNA，实现基因编辑功能。并于2020年3月4日，张锋领衔的基因组编辑公司Editas Medicine和全球领先的制药公司艾尔建（Allergan）宣布使用CRISPR基因编辑疗法进行世界首例患者体内给药。
然而近期，张锋团队又发现CRISRP系统除了可以进行高效地基因编辑（主要是Cas9酶）之外，还可以进行基因检测（Cas13,Cas12a,Csm6），相关文章已经发表在Nature和Science。这里先介绍一下浙大团队和复旦团队一起合作开发的Cas12a基因检测系统。
Cas酶介绍
CRISPR_Cas核酸酶主要包括两类：一类是RNA引导下可以切割RNA链的Cas13a和Cas13b；另一类是RNA引导下可以切割DNA链的Cas12a和Cas14。Cas12a和Cas13都有一个共同特点，除了切割靶向DNA或RNA序列之外，还可以切割其他DNA或RNA序列，但是Cas13酶的这种附加切割能力比Cas12a要强。
Cas12a的靶基因是ssDNA和dsDNA，并且Cas12a引导链需要识别PAM序列（Cas12a的PAM序列为TTTV）。
Cas12a介绍Cas12a酶的附加DNA酶切功能，可以切割特定单链DNA探针（荧光和淬灭标记），实现核酸检测。RPA扩增的双链DNA，在crRNA的引导下Cas12a可以切割双链模板DNA和荧光标记探针，探针被水解后释放出荧光信号，通过检测荧光信号便可知道是否有DNA模板。CRISPR-Cas12a快速核酸检测系统浙大和复旦团队将RAP扩增技术和Cas12a的这种所谓的“脱靶作用”，进行结合实现了基因快速检测。首先进行RPA快速等温扩增，扩增过程只需要15min，并且在扩增反应管中，除了包括RPA扩增的所有体系之外，也包括除Cas12a酶之外酶切的所有体系，他们是将Cas12a酶固定在扩增反应管壁上。
RPA扩增15min后，通过离心作用，Cas12a酶与反应液混合，再反应15min。因RPA扩增产物量较多，反应结束后可在蓝光（440-485nm）下肉眼观察到荧光。研究者将这种检测方法称为Cas12aVDt（Cas12a-based Visual Detection），也就是Cas12a依赖的可视化检测。此外，研究者发现该系统检测下线可以达到10aM。整个检测过程中RPA扩增的反应体系和Cas12a酶切的体系是混合在一起的，为了能让Cas12a有效地切割RPA扩增产物，作者通过大量实验摸索发现用NEB buffer 2.1有较好的酶切效果。而为什么在RPA扩增过程中没有将Cas12a一起加进反应体系，主要也是因为Cas12a可以切割双链DNA。如果在RPA扩增过程中加进Cas12a，将不会有大量的产物产生，也不会大量的荧光信号。

结论Cas12aVDet系统整个检测时间只需要30min，实现了快速检测。通过蓝光检测肉眼观察是否有PCR信号，实现了即时检测。检测下线可以达到10aM，实现了高灵敏度检测。所以Cas12aVDet是一种快速，灵敏和简单的DNA检测技术。

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