细胞培养过程中常见污染源介绍

小书虫

广义上来说，凡是细胞培养体系中的外来成分或成分变化，都应视为污染，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。细胞污染根据污染源主要可以分为物理性，化学性和生物性污染。

1、物理性污染

物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。常见的例子有：培养箱温度过高、周围放置能引起机械振动的设备、试剂放在有玻璃门的冰箱中长期受到光照等。物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。

2、化学性污染

培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。

3、微生物污染

微生物污染的原因可分为2个阶段：实验准备阶段和实验操作过程。准备阶段的原因包括：实验耗材灭菌不彻底；细胞房清洁度不够，增加微生物污染风险；超净台洁净度不够，消毒不够彻底，紫外线没有预先照射足够时间，表面没有用酒精擦拭；没有带无菌乳胶手套；试剂本身已经污染，没有检测出来。实验操作中的污染，往往是不够严谨，粗心大意造成，如：手从无菌试剂的上方经过；移液器操作不当，液体接触到移液器前端；移液管吸液过猛；吸头忘记更换，导至交叉污染等。

不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别，微生物中支原体和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的、缓慢的和潜在的。而霉菌和细菌增殖迅速，能在很短的时间内抑制细胞生长或产生毒素杀死细胞。

1）霉菌污染：种类很多，导至细胞污染的大多是曲霉菌、白色念珠菌、酵母菌、黑霉菌、孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不变混浊。倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝，并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。处理：确认是霉菌污染，如果细胞种类不是特别的珍贵，直接放弃，并将实验环节彻底消毒。万不得已，可以尝试抗霉菌素如两性霉素B来清楚污染，实际操作中效果很难保证。

2）细菌污染：细菌污染较常见的有大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单孢菌等。加用抗菌素的培养液可预防和排除个别一般少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很容易发现，多数情况下培养液短时间内变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显浑浊现象；有时静置的培养液起初不混，但稍加震荡，就有许多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，有时在细胞表面及周围有大量细菌存在，细胞停止生长并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以明确细菌种类；有的培养液改变不明显而有疑似污染，亦可向肉汤培养基内地入少量培养液，37度培养以检测。处理：一般用抗生素的常用量的5-10倍作冲击疗法，用药24-48小时后再换常规培养液，有时在早期污染时此法有效。

3）支原体污染：支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物，约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，在光境下不易看清内部结构。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6—8．0)，对酸耐受性差，对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。支原体污染细胞后，培养液一般不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重情况，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。如何确定是否有支原体污染，一般可用培养法或荧光染色法检测，市场上有多种支原体检测的试剂盒，本人试用过几种，先达基因（gendx.cn）的ERA法支原体快速检测试剂盒还不错，两步操作，20min出结果，灵敏度较高、速度比较快、操作简单灵敏，可检出的支原体覆盖范围非常比较广，超过130（亚）种。

4、细胞交叉污染

细胞污染和细菌污染不同，细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在，但使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性，形态发生变化。污染过的细胞由于种类不纯，无法进行实验研究。

防治及处理：在进行多个种类细胞培养操作时，所有器具要严格区分，对每一种细胞按顺序进行操作，避免一起操作时造成的混乱；进行换液或传代操作时，滴管或*头要及时更换，避免把细胞带到培养液瓶中；所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。