细胞培养中支原体污染的检测方法

小书虫

由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。实验室新引进的细胞，应该比较采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用。为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性，中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。美国食品药品监督管理局(FDA)强烈建议，应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况。欧洲药典European Pharmacopoeia(EP,7 the dition,Section2.6.7.)规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要。

2017年先达基因（gendx.cn）研发了一种细胞污染支原体检测试剂盒，每次检测只需半个小时，减少了很多工作量，其原理是基于其自主研发的恒温核酸检测技术（ERA），结合恒温荧光定量检测仪，可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体，实现了快速、简单、灵敏的进行细胞支原体常规检测。

1956年，Robinson等首次发现细胞培养物中的支原体污染以来，对其形态、繁殖、分类、体外培养、细胞膜结构和膜蛋白分析、代谢途径等方面都进行了深入研究。1995年10月，来自马里兰盖瑟斯堡的基因组研究协会(TIGR)与位于ChapelHill的北卡罗来纳州立大学的团队合作，共同完成生殖支原体全基因组580kb测序，这也是人类首次完成支原体全基因组测序的，随后RichardHerrma实验室完成了肺炎支原体全基因组800kb的测序，使得支原体的检测进入分子检测领域成为可能。到目前为止，出现了很多支原体的检测方法，有传统检测方法（包括直接培养法和DNA荧光染色法）、ATP酶法、免疫法（ELISA法等）以及分子诊断方法（包括普通PCR和荧光PCR、LAMP，重组酶扩增技术等），这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。

培养法是最传统的支原体污染检测方法，也是最早的检测方法，基本实验步骤首先是将细胞培养物置于支原体肉汤液体培养基中，37℃培养3天后离心，将沉淀物转移至支原体固体琼脂培养基中，相同条件下培养，观察培养基中若有类似煎鸡蛋样菌落出现，则细胞被支原体污染了。培养法简单直观，大多数支原体可出现特有的典型菌落，但是支原体生长缓慢，培养一代大3-4小时，一般需要培养28天才能判断是否有支原体的污染，工作量大，而且有进一步扩大支原体传播的风险。支原体对培养条件比较苛刻，培养基成分质量或批次的不同都会对支原体的正常生长产生影响，而且有一些支原体无法通过培养法生长，因此使用培养法检测结果并不准确容易产生假阴性。为了减轻支原体培养法的工作量，缩短检测时间，需要一种快速简单的检测方法阻止支原体污染的扩散，出现了使用DNA荧光染色法检测支原体的方法。

DNA荧光染色法是利用荧光试剂Hoechst 33258等标记细胞和支原体DNA，荧光染料会结合到DNA的A-T富集区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数，所以可将其染色，染料在紫外光激发下产生黄绿色荧光，利用荧光显微镜观察支原体是否存在。正常细胞核区见边缘整齐清晰的荧光，胞质区无荧光。被支原体污染的细胞不仅在细胞核而且在细胞核外及细胞膜上均可见许多大小均一之荧光小点，即为支原体DNA，证明细胞被支原体污染了。由于该方法不需要培养支原体，只需要用荧光显微镜观察，操作较为简便，检测快速。但是该方法灵敏度比较低，因背景荧光的存在，细胞轻度支原体污染不易检出。细胞裂解死亡产生碎片也会被荧光染料染色被误认为是支原体染色所致造成假阳性。DNA荧光染色法比细胞培养法检测缩短了检测时间但灵敏度和准确性不高且检测时需要荧光显微镜。荧光染色法不能确定具体是哪种支原体导至的细胞污染。荧光染色法一般要求培养无污染的指示细胞作为对照，增加了检测的工作量。

鉴于DNA荧光染色法的不足之处，出现了灵敏度和准确性更高的PCR（Polymerase Chain Reaction）检测支原体方法，Remy Teyssoud等以支原体的16SrRNA核酸序列中高度保守序列设计引物，采用PCR的方法检测细胞中的支原体污染。支原体作为一种原核生物，其rRNA基因是由保守和多变序列间隔排列而成，能够作为生物分类的指标。PCR以4种dNTP为底物，在引物存在的情况下，在DNA模板的3’末端进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板核酸得到指数级的扩增。PCR检测方法尤其适用于培养困难而且耗时的支原体的检测鉴定。

PCR法检测支原体基本步骤包括提取待测细胞上清，在PCR总反应体系中加入PCR缓冲液、氯化镁、Taq酶、dNTP、模板和引物，设置扩增条件扩增反应。取微量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外检测仪观察并用凝胶成像系统照相，观察是否有目的片段出现。PCR方法由于引物设计特异性较强，可以进行种属的鉴别。比常规培养法检测时间大大缩短，比DNA荧光染色法具有较高的特异性，能够鉴别支原体的不同种。PCR产物的分析一般采用琼脂糖凝胶电泳分析，初步判断PCR产物片段的大小与预计是否一致。但最令人头痛的问题是PCR 扩增产物污染，因为PCR 产物拷贝量大，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染，在操作时比较剧烈地摇动反应管，尤其是打开反应管的盖进行电泳点样操作时都可形成气溶胶而污染。一个气溶胶颗粒包含大量拷贝，因而由气溶胶造成的污染产生的假阳性是一个值得特别重视 的问题，而且PCR一次只能检测一个指标。随着分子生物学的发展，逐渐发展了利用荧光定量PCR技术进行支原体检测手段，如Melanie Stormer等利用荧光定量PCR方法快速检测细胞中的支原体污染。

荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR)是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种核酸新定量试验技术，荧光定量PCR是在常规PCR基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。在实时荧光定量PCR技术中Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR检测支原体主要的步骤包括支原体特异引物和探针的设计，阳性标准品的制备及标准曲线的绘制，荧光定量PCR特异性实验，敏感性实验和重复性实验，最后是用待测细胞上清液上机检测，通过Ct值及扩增曲线判断。随着实时荧光定量PCR的使用，出现了很多利用此技术检测支原体的研究，Lorenzon S等利用荧光定量PCR方法检测肺炎支原体capripneumoniae等，2017年Gerlier等发明了利用荧光定量PCR检测支原体的专利。实时荧光定量PCR简化了操作步骤，采用闭管检测可避免PCR跑胶导至的气溶胶假阳性的出现，敏感性高，可以实现实时监控，还可以实现定量判断。实时荧光定量PCR具有比PCR检测快，灵敏度高的优势，尤其适合样品模板含量较低时使用，实时荧光定量PCR能通过溶解曲线能够判断特异性扩增。实时荧光定量PCR需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，难以得到全面推广。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一种新兴的基因扩增技术，由日本学者Notomi 2000年在Nucleic AcidsRes杂志上公开发表，作为一种分子生物学检测技术，现先已广泛应用于分子检测领域，2005年Saito R等人发表了LAMP法快速检测肺炎支原体的文章。2014年HEYing等用LAMP方法快速检测capripneumoniae支原体，2016年美国Jonas M等发明了利用LAMP方法检测肺炎支原体的专利。 2016年曹振发明了一种检测广谱支原体的LAMP方法的专利。2017年Matsuzaki I等使用LAMP用于基因转移的快速检测。LAMP原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(如Bst 酶)的作用下，水浴锅中63℃左右，60分钟即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有很高的扩增效率，操作简单，检测不需要使用特殊的仪器。LAMP虽然增加了扩增效率，但引物间的非特异性配对容易导至假阳性结果，限制了LAMP方法的使用。

由于实时荧光定量PCR需要配套的仪器，且操作复杂，需要有经验的实验人员对检测结果进行分析，而LAMP法会出现假阳性问题，使实时荧光定量PCR和LAMP法在检测支原体污染上都存在一定的弊端，为了寻求一种使用简单，结果准确支原体检测方法，出现了利用支原体酶这一特定活性检测支原体的ATP酶法，如Lonza公司推出的商品化的Mycoalert支原体检测试剂盒，ATP酶法是采用生物发光的原理，检测支原体酶活性，其检测的支原体酶广泛存在于180多种支原体中，而这种酶不存在于真核细胞中。当支原体被裂解后，释放的酶与反应底物发生催化反应，将ADP转化成ATP，通过荧光分光光度计测量样品中添加底物前后ATP的含量，可以得到一个比率，该比率指示支原体是否存在。如果这些酶不存在，第二次读数相对于第一次读数就没有增加，如果酶与底物进行特异性反应，就会导至ATP含量上升。ATP含量的上升通过生物发光化学反应可以检测到，读数上升表明存在支原体污染。

ATP酶法能够检测的支原体种类比较全，检测结果能够量化，容易判断，耗时短，整个实验过程需要20分钟左右。由于ATP酶法主要依赖支原体酶活性的发挥，任何影响酶活性的发挥都有可能影响结果的准确性，2015年Vahid Molla Kazemiha等研究发现ATP酶法的灵敏度和准确性要低于实时荧光定量PCR法，ATP酶法需要使用荧光分光光度计，且商品化的支原体检测试剂盒价格昂贵，大面积推广使用成本较高，作者通过比较实时荧光定量PCR、和ATP酶法可以看出，基于核酸扩增检测支原体的方法在其灵敏度和准确性上仍是支原体快速筛选检测的首要手段。

恒温扩增技术因其操作简单、仪器控温容易实现已作为微生物快速检验的最重要的手段之一。目前在工业和科研领域最为常见的恒温扩增技术包括LAMP(Loop-mediated isothermal amplification method)和RPA（Recombinase polymerase amplification）。其中，RPA在扩增时间、扩增特异性、扩增所需要的能耗等方面均具有明显的优势。原理为通过反应体系中通常为30-35个碱基的两条特异性引物与重组酶形成复合物，在模板DNA上寻找同源序列发生链交换，并在DNA聚合酶作用下发生延伸。经过上下游引物在模板的特异性区段两端分别结合延伸，循环往复发生指数级扩增。扩增产物虽然可通过添加sybr Green染料实现荧光信号的增加，但因荧光染料无法区分非特异性，而通过反应体系中增加可以被核酸外切酶III或者核酸内切酶IV进行碱基类似物切除的方式的特异性荧光探针技术进行检测，从而大大提高了检测的特异性。目前RPA核酸检测技术现已应用到农业，兽医，生物制药等多个领域。Boyle等人研究发现RPA对于HIV-1的诊断是一个理想的技术，不需要复杂的温度循环设备，在恒定温度条件下20min内可以完成目的基因的扩增，对于HIV-1前病毒NDA检测灵敏度可低至3个拷贝。目前RPA技术已经在多个传染病病原和微生物检测领域得以广泛的报道，如用于致病性支原体或是某种病毒等的检测，但报道均为针对一种或完全同一类的病原进行检测，截止目前利用RPA技术检测细胞支原体污染的相关研究尚未见有报道。而支原体检测需要跨不同的物种进行检测，并且从进化树亲缘关系上，与支原体检测需要包含的物种如莱氏无胆甾原体其基因序列和大肠杆菌同源性更高，需要排除大肠杆菌的干扰同时包含莱氏无胆甾原体。因此通过常规序列同源性分析，无法在上述两条引物与探针之间设计特异性区段能够在同源性上既能包括常见的支原体污染类型，又能排除大肠杆菌序列。

先达基因自主研发的ERA恒温核酸扩增技术，通过酶工程改造，将来源于细菌和病毒的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，通过不同的DNA扩增反应体系进行优化组合，从而获得8种酶蛋白为核心的等温扩增体系。配好的反应体系在各种实时荧光定量仪或者先达基因自主研发的简易恒温荧光检测仪中，可实现恒温扩增与荧光信号检测于一体，通过实时荧光扩增曲线在20min内就可通过检测仪的显示屏读出检测结果，检测过程无需开盖，避免气溶胶的产生，结果可靠性大幅度提高。ERA结合先达基因提供的一步法提取DNA的试剂，进一步简化了支原体检测操作，5min完成细胞液的DNA提取，20min完成支原体DNA分子检测，整个过程只需30min。

ERA中的扩增酶具有较强的错配容忍性，而针对3’末端的错配将大大影响扩增的效率。通过在探针序列中，在碱基类似物两端待排除序列引入错配，从而通过特异性扩增的引物及和特异性剪切的探针组合，达到扩增特异性的检验目的。基于以上原则设计ERA上下游引物，引物在3’末端与大肠杆菌至少有一个碱基的错配，但与所有支原体3’末端并无错配，虽然在5’端与中间有个别碱基错配，但并不影响其扩增；并设计特异性的探针区段，在碱基类似物两端在待排除序列引入错配，从而通过特异性扩增的引物及和特异性剪切的探针组合。

综上所述，截止目前很多支原体检测方法已被开发出来，并多种检测试剂盒可供选择，但是这些方法或是因为敏感性差容易出现假阴性结果，或是因为检测范围小不能检测到所有的支原体污染，或是因为试验周期长费时费力。先达基因研发的恒温广谱支原体检测试剂盒，基于其实时荧光恒温核酸检测技术（ERA），可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，实现了快速简单灵敏的进行细胞支原体常规检测，较其他的方法更加实用有效。(先达基因 gendx.cn)

黄先生

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