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[讨论] 桔林杂谈(3)—纠结的PI+0.5

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发表于 2014-10-31 01:28 | 显示全部楼层 |阅读模式

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大家在查阅一些文献资料的时候,经常看到关于胶体金标记蛋白的最佳PH条件,理论上是PI+0.5。很多人对这种说法表示纠结。       纠结主要体现在两方面:
       其一,为什么应该是PI+0.5?为什么不是PI或者PI-1或者PI+1或者PI+2,3,4,5,6,7,8········?
       其二,我们在实际探索最佳标记PH的时候,有的蛋白最佳标记PH并不符合这个规律,难道这种说法是错误的吗?
       现在,我们从胶体金标记蛋白的基本原理出发,对这个问题进行讨论。
       众所周知,蛋白吸附金颗粒主要靠三种作用力:静电作用力、疏水作用力、配价结合。(假设是众所周知吧,不知的可以再查阅下相关文献资料,其实都是假说。)
       首先,胶体金颗粒周围是带负电的,而且是疏水的。
       当把胶体金PH调整至蛋白的等电点时,蛋白在此微环境下整体不带电荷,处于非常疏水的状态,因而很容易吸附到金颗粒上,但是往往一个蛋白会吸附周围多个金颗粒,一个金颗粒也会同时吸附多个蛋白,这样就会形成空间网状结构(类似海绵结构),反应在表观上,是金颗粒的凝集,颜色明显加深,由红色变为紫色或者蓝紫色。当金标记物形成大的基团之后,是不利于其进一步的离心纯化的,也不利于进一步的制作金垫,而且很容易产生非特异的反应。
       如果把PH调整至小于蛋白等电点,此时蛋白整体带正电荷,很容易吸附到胶体金颗粒上,中和胶体金的负电荷,就如同往胶体金溶液中加入电解质,会导至胶体金颗粒之间互相聚集,而且蛋白与胶体金颗粒也同样容易形成更加致密的空间网状结构。反应在表观上,是金颗粒的快速凝集,由红色变为灰蓝色,直至灰色、黑色、沉降。
       如果把PH调整到大于蛋白等电点,比如PI+0.5,此时蛋白整体带负电,这就有意思了,同样都是带负电,是相互排斥的,为什么蛋白还可以吸附到金颗粒上呢?(来个插曲,有的文献上说,大于PI时,蛋白整体带正电荷,因而可以吸附到带负电荷的胶体金表面。看到这个,我只能说:你们想错了!)蛋白含有的碱性氨基酸残基如赖氨酸残基、精氨酸残基、组氨酸残基其等电点相对较高,PH处于蛋白PI+0.5时,这些氨基酸残基仍然带正电荷,可以吸附到胶体金表面;而蛋白含有的酸性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸此时带负电荷,被胶体金表面所排斥。这样蛋白的氨基酸序列就会被伸展开,有利于特异性表位的暴露。此时,由于PH接近蛋白的等电点,蛋白相对较疏水,因而可以通过疏水作用力更加牢固的结合到金颗粒上,同时由于被排斥到外层的氨基酸残基带负电荷,使得金标记物整体带负电,互相排斥,而不会凝集,这样就会形成稳定的金标记物胶体状态。由于胶体金吸附了一层蛋白,粒径变大,反应在表观上,是胶体金颜色略微加深。
       如果把PH调整到远大于蛋白等电点时,比如PI+5,此时蛋白整体带有很强的负电荷,与金颗粒斥力很大,而且PH远离蛋白等电点,蛋白比较亲水,吸附金颗粒所需的静电作用力和疏水作用力都受到严重的影响,导至蛋白的吸附效率很低。但是由于蛋白与胶体金互相排斥,整个系统仍然是稳定的。极限条件下,会形成稳定共存的二相系统,金颗粒与蛋白互相没有结合,稳定共存。(当然这种极限状态是不容易形成的,以碳酸钾调整PH为例,随着碳酸钾加入量的增加,其作为电解质的作用会凸显,导至离心出现异常。)因此,我们在对标记PH做梯度性能实验的时候会发现,在一定范围内,随着标记PH的升高,特异性反应越来越弱,反之亦然。
       那么最佳标记PH应该是多少呢?我们可以想象下,在某个PH下,金颗粒可以牢固的、稳定的、高效率的结合蛋白才是我们想要的效果,而达到这种效果必然要接近并且略高于蛋白等电点才可以。因此,才有PI+0.5的说法。
       那为什么不是PI+0.1、0.2、0.3····呢?原因大致有三点:其一,相对较低的PH,如PI+0.1,金颗粒与蛋白的斥力较弱,不利于蛋白特异性表位的充分展开,所以,即使获得较为稳定的金标记物,表现在性能上,特异性反应也会较弱;其二、在产业化的生产过程中,由于批间、批内差异,客观上,我们不会选择极限的工艺条件,应该留下一定的性能浮动空间,不至于因为体系的略微变动而出现整体的非特异性反应;其三、在PI~(PI+0.5)之间,由于疏水作用力占有很大优势,可能会导至金标记物互相吸附形成一些较大的基团(如三五成群)。进而增加非特异性反应的风险。(第三点是很有意思的,我们以后再讨论。)当然,如果生产过程相对粗放,我们最好选择更高的PH条件,不用局限于PI+0.5,这只是一个理论值。
       打了这么多字,只解释了纠结的第一个方面。好吧,我们再说说第二个方面。
       为什么我们在实际探索最佳标记PH的时候,有的蛋白最佳标记PH并不符合这个规律?有的蛋白随着标记PH的升高反而表现出更强的特异性反应,或者特异性反应强度出现抛物线样的变化,或者······
       我们在解释PI+0.5时,并没有引入配价结合参与标记过程的机理。蛋白的半胱氨酸残基可以通过硫基与胶体金表面形成配位键,而这种结合作用力是非常强的,完全可以打乱上述规律。比如一个蛋白的氨基酸序列中含有相对较多的半胱氨酸残基,而这些残基分布在序列的多个位置上,牢固的吸附于胶体金表面,这样蛋白的特异性表位可能很难暴露出来。如果采用较高的标记PH,当斥力占绝对优势时,蛋白特异性表位将会暴露出来。反应在表观上,就是在一定范围内,标记PH越高,特异性反应越强。如果一个蛋白含有非常多的半胱氨酸残基,由于强大的配位键结合力,将会导至金标记物互相吸附,进而凝集、蓝变甚至沉淀。这可以解释,为什么有的抗原纯度虽然很高,也不含有干扰成分,但即使采用很高的标记PH,也无法标记成功。将抗原加入胶体金溶液中,即发生蓝变。
       另外一个典型的可以说明配位键对标记效果影响的例子是:硫柳汞,这也是胶体金产品中忌讳该防腐剂的原因。
       此时,我们会发现配价结合作用力与其它作用力对标记效果的影响,有时候会产生矛盾,而互相矛盾的作用力共同作用一个反应的时候,可能会出现抛物线样的性能表象。在抛物线的前后位置,代表了某种作用力更占优势,而在抛物线的顶端,是各种作用力的平衡点。
       在查阅文献资料的时候,我们还可能会看到一种说法,关于标记蛋白大致可以分为三类:PH非依赖型、PH非严格依赖型、PH严格依赖型。之所以有这种说法、出现这些现象,与三种作用力的共同作用有关。对于PH非依赖型和非严格依赖型往往与蛋白的氨基酸序列中含有相对较多的硫键有关。
       以上仅针对问题提出一些假说,用于解释某些实验现象,以加深对产品工艺优化的理解。很多情况下,为了说明问题,都是选择了理想的状态,请勿直接套用。


来源:小桔灯网   作者:涩涩的茶      
此文系作者原创,专供小桔灯网独家发布,转载请注明出处与作者。未经允许不得删改。
原文链接:http://bbs.iivd.net/thread-15611-1-1.html


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发表于 2014-10-31 07:20 来自手机 | 显示全部楼层
佩服的五体投地~
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发表于 2014-10-31 08:09 | 显示全部楼层
我要顶起来~~!!早起第一件事情就是看大神的帖子~~~
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发表于 2014-10-31 08:20 | 显示全部楼层
我就猜到今天不是转播,而是直播,涛哥果然熬到后半夜才发帖
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发表于 2014-10-31 08:27 | 显示全部楼层
我之前只是觉得ph改变导至蛋白本身发生构象改变,原来胶体金在蛋白构象的变化中也起到了这么大的作用。所以才说金标和乳胶共价标记差别很大,不光是纯度、亚型不同在标记时聚沉死金的问题,蛋白的构象变化也有很大的不同。

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发表于 2014-10-31 09:28 | 显示全部楼层
大神好厉害!好无私!佩服!爱你!
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发表于 2014-10-31 10:36 | 显示全部楼层
虎不堪言啊
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发表于 2014-10-31 15:43 | 显示全部楼层
佩服佩服
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发表于 2014-10-31 22:53 | 显示全部楼层
大神出山了。。。地板。。。
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发表于 2014-11-1 09:48 | 显示全部楼层
很全面
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发表于 2014-11-8 13:26 | 显示全部楼层
行家出手了
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发表于 2014-11-26 13:32 | 显示全部楼层
涨姿势了
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发表于 2016-2-23 15:12 | 显示全部楼层
学习一下。
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发表于 2016-2-24 09:29 | 显示全部楼层
膜拜大神
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发表于 2016-3-5 10:16 | 显示全部楼层
膜拜,膜拜,膜拜
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发表于 2016-12-1 10:35 | 显示全部楼层
本帖最后由 山火 于 2016-12-1 编辑

涛神分析就是透彻
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发表于 2017-6-23 10:57 | 显示全部楼层
PEG是非依赖型,它是配位键结合吗,对于封闭BSA和PEG有什么不同
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发表于 2018-1-9 17:21 | 显示全部楼层
这篇非常值得推荐,尤其是有1到2年研发经验的成员!!强烈推荐!
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