金桔
金币
威望
贡献
回帖0
精华
在线时间 小时
|
貌似很多文献都已经对这个问题进行过阐述，但是说的都很简单，比如纯化、透析除盐等，笔者根据多年的实践经验再举一些具体的例子来加以说明。
首先抗原、抗体要先纯化，貌似这个实在没啥好说的了，不过最近依然遇到有人直接标记和包被抗血清的情况~~很无语的说······
对于产业化应用的抗原、抗体，大部分都可以满足胶体金方法的要求，但是由于国内原材料市场比较混乱，很多供应商并不确定自己的抗原、抗体是否能够应用于胶体金方法。相对来说，胶体金方法对抗原、抗体的要求是比较高的，因为不管是胶体金标记还是NC膜包被都是基于物理吸附作用，这种结合过程是相对脆弱的，很容易受到干扰。
1. 对重组抗原来讲，基于镍柱纯化的蛋白会含有大量的咪唑，而微量的咪唑足可以使胶体金聚集、死金、沉淀；而以包涵体形式表达的蛋白，往往需要高浓度的尿素来溶解，尿素对胶体金的破坏也是非常严重的。
在蛋白的保存过程中，供应商可能会加入一些甘油、蔗糖之类的物质作为保护剂，而这些保护剂由于其强亲水性，对胶体金方法的标记和包被都会产生不利的影响
2. 对于天然抗原，原则上，不推荐直接用于胶体金的标记和NC膜的包被，因为天然抗原往往浓度和纯度都很难满足要求，当然如果可以获得足够的纯度和浓度，也可以使用。
3. 对于多抗来说，应避免某些纯化方法（如硫酸铵沉淀）所产生的强电解质和高盐成分。
4. 单克隆抗体，需要特别注意的是不同的单抗类和亚型对胶体金标记的影响，一般来讲，IgG1亚型标记效果最好，其它亚型和类或多或少存在一定的局限性，但是我们经常会筛选到IgG2a、IgG2b这些亚型，甚至偶尔会遇到IgM、IgA这些类，此时，最好用于NC膜的包被，绝大部分的亚型和类包被NC膜都没有问题，如果确实需要用于胶体金标记，建议有条件使用（如高标记PH，低标记量，强封闭）。
如果抗原、抗体存在上述干扰物质，建议可以通过超滤或者透析去除。很多人反馈在透析重组抗原的时候，很容易产生大量的沉淀，导至抗原失活，特别是包涵体抗原。主要原因是透析液不太合适，应选择尽量偏离蛋白等电点的PH缓冲液，如果不确定蛋白的等电点，建议用20mM Tris-HCL(8.5)或者20mM Tris-甘氨酸(8.5)来做透析液，经笔者验证，适用于绝大部分的抗原抗体。
PS:比较理想的抗原、抗体保存液：10mM/20mM PB（7.4~8.0）、10mM/20mM PBS（7.4~8.0）、20mM Tris-HCL（8.0~9.0）、20mM Tris-甘氨酸（8.0~9.0）。另外，可加入适量防腐剂，如：0.1%~0.5%叠氮钠，不推荐使用ProClin300防腐，ProClin300对胶体金标记会有一定程度的影响，虽然这种影响并不是很严重，但是有潜在的风险。
此文系作者原创，转载请注明出处：小桔灯网，原文链接：http://bbs.iivd.net/thread-20017-1-1.html
|
|
[复制链接]
/3 
浙公网安备33010802005999号 
2024庆中秋、迎国庆
2024庆【网站十一周
2023庆【网站十周年
2022庆【网站九周年
2021庆中秋、迎国庆
2021庆【网站八周年
雷达卡
发表于 2015-4-21 10:35
提升卡
发表于 2015-4-21 10:38
发表于 2018-7-29 14:23
