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Immunogold conjugation for IVD applications NikkiRobinson 制备有活性的免疫金复合物，需要克服许多技术挑战。 任何蛋白（包括抗体和抗原）都可以结合到胶体金上制备免疫金复合物。有些项目是刚刚兴起，目前主要应用于疾病的诊断和监测。过去10年，基于膜的检测试剂（包括侧向层析和渗滤）为金标试剂开拓了一个巨大的市场。金标结合物作为检测试剂应用于变态反应、传染病、环境污染、毒品、心肌标志物、妊娠相关以及兽用检测。 像其他结合物一样，成功的试剂需要高质量的原料（蛋白和胶体金），充足的制造经验，充分的背景知识，以及客户培训等。
Proteinsfor Conjugation 在IVD领域，蛋白的类型是抗体和抗原。 影响抗体标记的一个因素是抗体种类（单克隆或多克隆抗体）。最常用的抗体是IgG，但是IgM, IgE, 和IgA也可以标记到胶体金上。 更深层次的考虑是抗体的亚型，如鼠IgG抗体，IgG1成功率很高，而IgG3面临技术上的挑战。 标记抗原也有技术挑战。虽然将抗原标记到胶体金上并不困难，但是由于蛋白结合到胶体金的方式问题，胶体金不掩盖抗原的特异活性位点的几率只有50%。因此，需要考虑蛋白与胶体金结合的方式。
BindingMechanisms 结合机理 研发人员普遍接受的结合机理是，三种特殊类型的氨基酸残基扮演关键角色。包括赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸，各有不同原理去引起结合。 ①赖氨酸：带正电荷，通过静电作用，与带负电荷的胶体金结合。 ②色氨酸：疏水作用力。 ③半胱氨酸：金硫键，抗体和金共用电子对，所有结合力中，金硫键最强，最持久，最难打破。 标记成功很大程度上取决于这些氨基酸在待标记蛋白中的位置。在一些情况下，位置不合适的氨基酸结合到胶体金分子上，致使胶体金实际上影响了蛋白的结合能力。空间位阻现象，这种干扰发生于：特殊氨基酸在抗体的Fab端（结合抗原的位置），或者在抗原的活性位点上（与抗体结合的部位）。这样的干扰几乎不可能克服，除非妥协之下破坏蛋白分子的完整性。 为了得到最佳灵敏度，标记蛋白中这些特殊氨基酸的位置必须合适。对于抗体，他们最好在FC区；对于抗原，他们最好远离结合位点。
OptimizingConjugation 优化结合 为了开发和优化结合，需要开发者小批量试制60种不同的结合物。每一种在一个关键因素上与其他不同，用每一种结合物制备成品进行试验，看哪一种能够达到预期目标。 这些测试围绕所有参数：适当的灵敏度、交叉反应、结合物的稳定性。测试的特性包括但不局限于：抗体保存液、防腐剂类型、盐浓度、表面活性剂含量、金颗粒大小、封闭剂类型、总蛋白浓度、胶体金稀释液、结合物浓缩倍数。 确定不同封闭剂的效果时，还要考虑以下问题： ①封闭剂类型（BSA、酪蛋白、OVA、人白蛋白、PEG、杂IgG） ②封闭剂的纯度等级 ③封闭剂的浓度 ④封闭剂与整个系统的相容性。 工艺条件确定后，开发者需要在扩大生产中再次确定上述因素的最优条件。最终选择哪种结合物还要制成成品模仿最终检测环境进行试验。 对于层析测试，简单的方式是用半条进行试验（湿法），仅需要捕获抗体和纯抗原。用这样的简单形式，能够评估很多结合物是否适用于此项目，但是不能发现干燥或样品缓冲液制备方面引起的问题。 为了进行所有试验，大概需要3mg抗体或者5mg抗原。用这些小样本，开发者可以优化制备结合物的参数和预实验。一旦制备了高质量的结合物，制备参数也已经确定下来，需要确保忠实再现并且放大生产复合物。 Qualityof Materials for Conjugation 原料的质量 制备复合物时，一种特定抗体的适应性，取决于测试的技术形式。 对于层析法，最好的抗体类型是使用单克隆抗体对。在这种情况下，一种单抗标记上胶体金作为检测因子，另一种固定到NC膜上作为捕获试剂。每个单抗针对待测抗原上的不同结合位点，这些结合位点在空间上要相隔足够远。 多抗也可以使用，但他们最起码要经过protein-A纯化，亲和纯化能够提供最好的灵敏度和特异性抗体。这取决于可接受的交叉反应水平。
AffinityPurification 亲和纯化 饱和硫酸铵沉淀，或者DEAE纯化血浆，包含一些竞争胶体金结合位点的杂蛋白。含有大量特殊氨基酸的杂蛋白会更容易结合到裸露的带负电的胶体金表面，然而这些对检测毫无贡献，发生这种情况后，检测试剂的灵敏度会严重下降。 类似的，如果抗体经过protein-A或者protein-G纯化，抗体中会残留部分杂IgG。他们也会和目标IgG竞争胶体金结合位点，从而降低灵敏度。 亲和纯化：得到的抗体纯度最高，制备的金标复合物特异性最好，这些抗体也许需要进一步的纯化来修正其交叉反应特性。尽管亲和纯化的成本昂贵，但是他能够提供高质量的金标结合物，这对于测试来说是最主要。
AntigenConjugation 抗原标记 成功的抗原标记有两个因素：大小，和特殊氨基酸的情况。 大部分抗原标记复合物用于快速检测，包括夹心法和竞争法。对于这些测试来说，40nm胶体金最常用，之前认为能够标记到40nm金上的最小颗粒质量是30KDa。在一些情况下，可以标记上7.5KDa，能够标记成功的最主要限制是这些小分子含有充足的特殊氨基酸残基。 抗原所含的半胱氨酸常常不足，因此抗原与胶体金的结合相对较弱且容易分离，特别是样本中含有高亲和系数的抗体时。 对于分子量小于30KDa的抗原，可以用其他技术，像标记到小颗粒的胶体金，这可能会降低灵敏度（因为小颗粒金相对不容易观察到）。 如果抗原含量极少甚至不含特殊氨基酸时，有效的解决方法是将抗原交联到载体蛋白上，如BSA或KLH。但是这项技术并不像听起来那么简单，而且不是业余人员能够办到的。交联子的类型、长度，半抗原和BSA的摩尔比。而且使用的载体分子只是其中的一部分因素，需要实施可重复的交联，并且需要暴露抗原的活性位点，才能获得高灵敏度的金标—载体—抗原复合物。
SizeMatters 尺寸问题 胶体金颗粒的尺寸，需要结合预期应用来选择。下面要讨论的是两种不同的应用环境：显微镜检查和快速检测试剂。 Microscopy 颗粒大小在1-40nm金都可以用于电镜或显微镜检查。1-2nm的金在250000x的透射电镜上也不易观察到，但是通过银增强显色可以实现。 银增强技术在金颗粒表面沉淀银盐，可以让金颗粒大小增加到可以在显微镜中观察。金颗粒均匀是这项技术很好实现。使用小颗粒金，如1-2nm的，容易利于抗原保持活性位点（相比之下大颗粒金的空间位阻现象会掩盖活性位点）。因此金与抗原结合后，容易连接并且通过银增强变大。 对没有银增强的电镜来说，几个不同的活性位点可能标记到同一胶体金颗粒上面。在这种情况下，不同颗粒大小的金，用于标记针对不同活性位点的抗体。
Rapidtests (lateral-flow and flow-through devices). 最常用的是40nm的胶体金。 在标记IgG时，40nm的胶体金提供了最大化的视觉观察效果的同时相对空间位阻降到最低。一个分子量160KDa的IgG分子长度大约8nm。 金颗粒在40—100nm之间都可以标记IgG抗体。大的颗粒比40nm更容易观察，但是在同一OD520nm数值时，1ml溶液中含有的颗粒会变少，所以能够捕获到T线的颗粒也减少。这意味着在待测物含量较低时（1—10ng/ml），产生的信号会比40nm—60nm胶体金少。 60nm胶体金不常使用，但是对于快速检测试剂来说也很重要。他的颜色与40nm有轻微不同，高质量的40nm金是樱桃红色，而60nm金是深粉色（偏紫色）的。在检测一些特殊样本，容易造成膜背景不干净时，细微的颜色差别会使信号更容易判读。例如：样品中含有胆红素会留下褐色的背景，这时粉色（紫色）比红色更容易观察。 如果分子量小于160KDa，20nm的金更合适些。20nm金常用于抗生素、蛋白A，以及抗原的标记，这些标记物分子量小于60KDa。
Sensitivity 目前，大部分金标灵敏度是1ng/ml，如果有高质量的抗体灵敏度可以降到10 pg/ml。然而，银增强技术可能会10-100倍的提升灵敏度。
Conclusion 金标记技术并不容易。制备金标复合物可能很简单，但是提高质量很难，在批间重复性和放大生产上面也会遇到问题。
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发表于 2013-5-29 09:01
