白话胶体金系列——第一话<烧金>

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本文的目的是梳理一遍胶体金免疫层析产品研发实验的流程，为新入行没人带的研发人员或高校学生提供一个参考，因此不会写成文献那样的假大空，本人不卖原料不卖设备不卖身，因此也不会写出广告和推销的内容，尽量写成一个SOP，让人照着就能往下做，另外会多写上一些理论方面的探讨（理论探讨远多于实验操作内容），在需要优化的时候，提供一些思考的方向，因为这个平台本身操作并不复杂，但是问题很多很多，储备一些理论知识，有助于解决将来遇到的问题。

这个行业发展很多年了，各家公司有各家的思路和体系，我说的话虽然有一些博采众长的经验之谈，但在这个领域，很多情况下还是理论不明，只有一些假说，甚至假说都没有，另外即使理论正确，遇到特殊的原料，还是会让你怀疑人生，所以实践和结果才是最重要的，追求极致就得多研究细节。其实我主要想说的是，文中涉及的理论和假说，仅在于帮助理解实验现象，为解决问题提供一些想法，而无意否定别的公司别的人的现行做法和想法，欢迎大家踊跃探讨，错误之处，欢迎指正。

另外，本文原载于《小桔灯网》，欢迎转载，转载请注明出处。

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第一话——烧金

（一）基本概念：

1.金子大小：常用20、40、60nm的胶体金颗粒（粒径大小），另外，在说金子大小的时候，有些人还用λ525、530表示，这个是指胶体金最大吸收峰位置，理论上这个值比说40nm要准确，因为40nm是估的，这个是实实在在测的，但是他与颗粒大小仅仅有“一定的“关系，而且这个”一定的“很不一定。其他要说明的是，颗粒越小，颜色越粉嫩（偏粉红），最终显色越弱，特异性相对越好；相反颗粒越大，颜色越老土（偏紫，但70nm以上就真的土了，有点泥巴色了），显色越强，特异性相对越差。

2.金子浓度：万分之一、万分之二、万分之四等等，指烧金时溶液中氯金酸的浓度。由于反应非常迅速，浓度越高，金子质量越不容易控制，标记时的表现也是这样，高浓度金不容易控制。注意当别人问你用多大浓度的金子时，不要回答人家40nm或λ530的，这会比较尴尬。

3.反应原理：氯金酸被柠檬酸三钠还原成胶体金颗粒，其过程为金离子（并非全部）→还原成金原子→迅速形成20面体的金核→其他金原子吸附到晶核上→生长成椭球形的带负电的金颗粒（双电层结构，胶体金表面吸附着负电的AuCl2-离子，相对的H+则分散于胶体之间的溶液中）。

氯金酸一定时，还原剂数量决定了最初的晶核数量，决定了胶体金颗粒的大小。还原剂越多，晶核数量越多，最终的颗粒体积越小，通过控制二者比例，我们可以制备不同大小的胶体金颗粒。常用的40nm左右的金，发红色，一般是1:1的关系，由于不同厂家原料也有影响，如果你感觉烧出来的偏紫，又很想要红色，下次烧金就再稍微增加点还原剂即可，试剂比例--金子大小--最大吸收峰--颜色，这四者的对应关系各种文献说法不一，我们也没必要太纠结。如前所述，金子大小与最终的产品性能有一定的关系，所以重要的是实验之初你要从试剂盒反应原理上确定是要大金子还是小金子，而不用去纠结40nm还是50nm，酒红色还是红色，最大吸收峰位置是525还是528。

烧金最重要的是一致性，不要这次烧出来粉红的，下次相同条件烧出来紫的就行了。而这个很考验细节，理论上，发生反应并且形成晶核的均一性，决定了最终胶体金颗粒的均一性，不幸的是，这个过程太快了，很难控制，发生的一瞬间结果就已经注定了。就像生孩子一样，你再怎么想要闺女，最后生出来也可能是个儿子，而你只能安慰自己生男生女都一样，然后默默的努力挣钱给儿子存老婆本。

4.胶体的稳定性问题：胶体金本身是疏水胶体，会因疏水作用力结合而聚集（随着聚集的程度加重，颜色由红→紫→蓝→黑），但因颗粒外层负离子的静电斥力而稳定悬浮于水中，加入NaCl等盐离子会破坏负电斥力（其实调节PH加碳酸钾也有这种影响），导至胶体金颗粒通过疏水作用力结合而死金，而我们标记后的胶体金因为结合了蛋白和合适的封闭，变成了亲水的胶体，减少了疏水结合的位点，所以正常来说金标物更稳定，更耐受环境的破坏（当然不稳定的情况也很常见，比如标记死金，封闭死金，离心死金，复溶死金，甚至层析过程中死金，遇到这种情况有一个好办法，就是想办法让他稳定，原理就摆在这里了），这也是优化标记条件时NaCl滴定法的理论基础，但理论是个好理论，只是NaCl滴定法不正经，不推荐使用，后面标记的章节会再次介绍。

关于稳定性问题，也有说是盐破坏了胶体金的水化膜导至聚集，但是亲水胶体才主要由水化膜起稳定作用，比如蛋白质，而破坏水化膜需要大量的盐，即盐析作用。相反，胶体金是疏水胶体，几乎不形成水化膜，少量盐就会导至死金，所以我认为，胶体金稳定主要是靠负电斥力（而非水化膜），这也是维持疏水胶体稳定的主要作用力。

5.死金：是指胶体金聚集状态，表现多样，轻者整体变紫，重者变黑并沉淀，还有漂在表面的一层油状物，或悬在液体中的一些不溶物。我们研发时一般都追求稳定的不死金的状态，而死金的状态能够达到更高的灵敏度，所以在某些具体产品上，或者某些公司的整体考量上，也有追求死金的时候，所以你看到别人的产品跑出来深紫色或者黑色的线条，也无需大惊小怪。

（二）基本操作：煮1/万胶体金，40nm左右的金子。

1.使用18.2兆欧水将氯金酸配制成1%的溶液，再取1%的氯化金1ml稀释成100ml（即0.01%）。

2.将0.01%的氯金酸溶液100ml置于干净的烧杯或锥形瓶中，在液面处做好标记，在磁力搅拌器上加热并快速搅拌，待初沸，一次性快速加入1%的柠檬酸三钠溶液1ml（加液的工具比如枪头、注射器等要清洁），持续搅拌。

3.接下来就是等，虽然还原及成核反应很迅速，但整个过程相对比较漫长，可以观察到明显的颜色变化，黄（氯金酸颜色）→灰黑（浑浊）→红（透亮），大概的趋势是这样的。变透亮的红色后可以停止加热，适当低速搅拌几分钟，之后放到一边冷却。

4.待冷却后补水至标记处，避光待用。无需过滤，常温和冷藏存放均可，不可冷冻。

（三）注意事项：

1.器皿：因为胶体金有洁癖，所以器皿需要彻底清洁，可以泡酸，玻璃洗涤剂+超声也行，最好别用含表面活性剂的洗涤灵。这也是标记时推荐用玻璃瓶的原因，ep管很不干净，又容易产生吸附。早期的论坛帖子都说为了防止玻璃器皿吸附胶体金，要硅化处理，硅化试剂有毒，咱们只是烧烧金子，又不是抢黄金，没必要把小命搭上，如果怕胶体金吸附在玻璃器皿壁上，可以固定容器烧金，相当于用胶体金代替硅化。

2.原料：氯金酸特别容易吸潮，吸潮后虽说也可以用，但是因为水份的存在，称量就不准了，所以最好将1g氯金酸直接配制成1%的溶液100ml，再分到小的ep管里，可以-20℃避光冻存，纯化学物质，冻存主要是防止污染和长菌。如果少量称量的话，要注意氯金酸对金属有腐蚀性，所以要用塑料药匙，他特别吸潮，所以直接用容器称量而不要用称量纸，1%氯金酸溶液就是1g氯金酸+99ml水（可以等比例变化），不用管他的纯度、结合水、金含量等，就是氯金酸直接称重。另外需要注意的是，不同厂家氯金酸，相同配比烧出来的金子大小会有差异。

3.水：之前讲过盐离子对胶体金稳定性有破坏作用，因此最好用18.2兆欧水（电子行业所称的超纯水），没有这种制水设备的话用三蒸水，实在不行的话，据说也可以用娃哈哈纯净水。

4.加热工具：制备胶体金，温度在95℃以上即可反应，一般控制在100℃左右，过高的温度可能导至加热接触点的胶体金脱水死金，最终会在胶体金溶液表面漂一层油状物（虽说水的温度是100℃，但加热的接触点温度会很高）。常用的加热磁力搅拌器、加热套、电炉、微波炉等。出于控温的考虑和搅拌的要求，少量研发推荐用加热磁力搅拌器。

5.加液顺序：有上述加完氯金酸加热，沸腾后再加柠檬酸三钠的，也有先煮水，沸腾后再加氯金酸，之后再加柠檬酸三钠的，还有先加柠檬酸三钠再加氯金酸的，感兴趣的可以都尝试一下。不管哪一种加液顺序，都要求迅速加入、迅速混匀。

6.搅拌和控温：前面反应原理中提过，这个反应非常迅速，而想获得均一的胶体金颗粒，初始反应时，需要液体中试剂充分分散均匀、且各点反应温度相同、且同时发生反应，这样所有的晶核将在瞬间同时形成，最终形成的胶体金颗粒将具有同样的粒径。说起来容易做起来难，但这至少指明搅拌和控温在胶体金制备中有很重要的影响，尤其在大量煮金的时候，液柱高度、沸腾程度、加液时机、加液顺序和方式、反应温度、搅拌速度等等都需要研究优化。

7.补水：加热沸腾必然会流失一部分水，我们可以采用上面的做标记最后补水的措施，也可以在瓶口盖块玻璃片防止水蒸气流失。

8.胶体金的Ph：制备好的胶体金Ph在5、6左右，大颗粒的金因为氯金酸比例相对高，Ph会稍微低一些。因为胶体金会吸附Ph计电极，不建议用Ph计测，又因为Ph试纸本身就不太准，胶体金的颜色也会有一些影响，所以也没必要用试纸测，在标记时也是如此。那为什么还要废话的提一下Ph呢，这和后面的标记有关，方便理解标记时的现象。

9.主要参考文献：丁香园早期翻译的《高质量金溶胶的生产》、丁香园各种帖子、涛哥答疑录。

（四）胶体金的质量检验：

1.肉眼观察：主要评价参数“颜色”，“浑浊与否”，“有没有漂浮的油状物（有的话，用枪吸出去就好了）”。

2.分光光度计扫描：通常做法是扫描450-650nm的吸收曲线，然后看3个不靠谱的参数，①最大吸收峰位置对应胶体金粒径，颗粒越大，最大吸收峰位置越大；②峰宽对应颗粒均匀度，峰形越细颗粒大小越均匀；③最大吸收峰OD值与相对浓度有关。

这三个参数理论上正确，用起来并不理想，以实际经验说，比如你测BBI的商品化40nm胶体金，他的最大吸收峰在526，半峰宽=42nm，最大吸收值0.94，当你测几组自己烧的金，最大吸收峰位置一样是526，但是可能明显看到这几组金子颜色不一样，电镜结果也显示这几组金子的平均直径分别是30到60nm之间（别笑，这是真实数据），因为最大吸收峰不光与颗粒大小有关，颗粒的形状也有显著影响，因此最大吸收峰这个参数并不能准确预测颗粒直径。再说峰宽，如果你测得峰宽都在50、60，那说明你的金子均一性确实比BBI的差很多，那要是你测出来也是42，甚至40，能说明你的均一性好吗？结果是否定的，因为这个峰宽跟峰形有很大关系，有聚集的金子，会导至峰形变化，峰宽会很不确定，有可能变大，也可能变低了。最后这个最大吸收峰OD值与在这里产生吸收峰的粒子的相对浓度有关，可以考虑用他控制相同工艺下金标复合物的复溶比例，但是没法用他横向比较不同金子。所以最终你可以扫描出一条有模有样的曲线，但从这个曲线上，你找不到任何控制金子质量的有效方法（至少以上在文献中出镜率最高的三个参数不行，其他的有待发现。下图是峰形对比，红线为BBI金子，蓝线为自制金子，差异虽然比较明显，但是如何在没有对照的情况下提炼参数，或者加对照设置参数，让质控标准可测量化、数值化？偏离到何种程度，体现到产品性能上完全不能接受？）。

3.电镜：直观，能看到颗粒形状是否规则，大小是否均一，有无聚集等情况，设备成本高，我没做过，没啥好说的。

4.粒径分析仪：可以看出粒径大小和CV，可以通过PDI判断金子是否聚集，比分光光度计有用，比电镜实惠，但是价格也不便宜。

第一话完。

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第二话——标记，另开一贴

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第三话——划膜，酝酿中……

四少

抢沙发，哈哈哈

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第四话——反应体系，酝酿中……

numbrg

第五话，想起什么说什么，占楼11111111111

ty10086

看得出楼主是一位资深技术拥有精彩的实践经历和富有丰富理论的胸有成竹。
此时此刻，我为楼主深入浅出的分享而点赞。
顺祝好人一生平安！

RealMarid

强势插入楼上后面                                                                                                         







的楼层。







楼下是猪

笑看风云

期待，期待。。。。。

joker9170

坐观高手下文

lilywang123

新人报道！果断留名！

山火

期待ing。
胶体金pH值，可以高速离心后测上清，放大过程更靠谱。

卡卡

就期待这种原创交流。谢谢。

木吉火丁

numbrg 发表于 2016-11-30
第一话——烧金（一）基本概念：1.金子大小：常用20、40、60nm的胶体金颗粒（粒径大小），另外，在说金子大 ...

感谢原创，部分文章图片引自qq空间不能显示，可以联系客服qq31339393，让客服帮你上传。谢谢。

numbrg

山火 发表于 2016-12-1
期待ing。
胶体金pH值，可以高速离心后测上清，放大过程更靠谱。

这是一个方法，有些公司不怕费PH计，放大过程中也直接拿PH计测量。

numbrg

小桔灯 发表于 2016-12-3
感谢原创，部分文章图片引自qq空间不能显示，可以联系客服qq31339393，让客服帮你上传。谢谢。

好的，等图片多起来我再联系客服，这里面图片不多，有些人能看，有些人说看不到，不知道什么情况。论坛啥时候能直接上传图片就省事了。

木吉火丁

numbrg 发表于 2016-12-5
好的，等图片多起来我再联系客服，这里面图片不多，有些人能看，有些人说看不到，不知道什么情况。论坛啥 ...

因服务器空间有限，所以没有开通图片上传功能。但可以引用其他网站的图片，只是qq空间特殊。会屏蔽不显示。

山火

numbrg 发表于 2016-12-5
这是一个方法，有些公司不怕费PH计，放大过程中也直接拿PH计测量。

太壕气！

chenjinghua3615

顶顶顶！！！！