化学发光标记物：辣根过氧化物酶（HRP）

辣根过氧化物酶的结构

辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高，主要由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成。糖蛋白中糖含量一般是18~22%。糖由半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、甘露糖胺和半乳糖胺组成，具体取决于特定同工酶。HRP的相对分子质量约为40,000，由300个氨基酸和4个二硫键连接而成。HRP (40 kDa) 比碱性磷酸酶 (AP，140 kDa) 小，并且比 AP 和 β-半乳糖苷酶 (b-Gal) 具有更高的比酶活性。其等电点通常在pH 5.5～9之间，最适pH值通常在5左右，但不同同工酶的最适pH可能略有不同。HRP易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液，溶液呈棕红色透明状。

辣根过氧化物酶实际上是由多种同工酶组成的，其中以中性辣根过氧化物酶同工酶C（HRP C）的含量最为丰富，研究最为清楚，应用也最广泛。HRP C的单肽链由308个氨基酸构成，肽链上存在二硫键和盐桥，并有多个潜在的糖基化位点。此外，HRP C含有两个不同的金属中心：正铁原卟啉（血红素）和两个钙原子，这些对酶的结构和功能至关重要。

辣根过氧化物酶的酶蛋白分子中，因含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，故在大约275nm处展现出强吸收带。而其辅基部分的正铁原卟啉（即血红素）的最大吸收光谱则位于403nm。这两个吸收光谱的比值OD403/OD275，被称为RZ值（Reinheit Zabl，德文），用于衡量酶的纯度。具体而言，RZ值大于3表示高质量，RZ值大于2.5为中等质量，而RZ值小于2.5则提示需要纯化。然而，RZ值仅反映了血红素基团在辣根过氧化物酶中的含量，并不能代表制剂的真正纯度，同时RZ值高的制剂也并不意味着酶活性就高。事实上，RZ值与酶活性并无直接关联，酶活性是以单位U来衡量的，即每分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。在免疫标记应用中，高纯度的酶通常具有约3.0的RZ值（最高可达3.4）。因此，在选择辣根过氧化物酶（HRP）时，应综合考虑酶活力和RZ值这两个因素，首先关注酶活性，其次再考虑RZ值，以便选择出最适合的酶产品。

在化学发光领域的应用

辣根过氧化物酶在化学发光领域的应用十分广泛，主要得益于其催化化学发光底物产生强烈光信号的能力。HRP可以催化诸如ABTS、TMB等化学发光底物生成氧化态化合物，这些化合物在可见光范围内产生强烈的光信号。这一特性使得HRP在化学发光免疫分析、生物成像和DNA检测等领域具有显著优势。

在化学发光免疫分析中，HRP通常与抗原或抗体偶联，形成标记复合物。当标记复合物与待测抗原或抗体结合后，通过加入适当的底物和氧化剂，HRP催化底物发光，从而实现对目标分子的检测和定量分析。这种方法具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，广泛应用于临床诊断、环境监测和食品安全等领域。

在生物成像方面，HRP可以标记在特定的生物分子上，如蛋白质、抗体或核酸等。通过化学发光技术，可以实现对这些标记分子的可视化，从而揭示其在生物体内的分布和功能。这种方法在细胞生物学、分子生物学和组织学等领域具有广泛的应用前景。

戊二醛法标记步骤：

戊二醛交联法则是通过戊二醛的醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。这种方法标记步骤简单，重复性好，但酶的利用率较低。

(1)称取一定量HRP溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

(2)将反应后的酶溶液用脱盐柱纯化后，收集棕色流出液。

(3)将待标记的抗原或抗体用生理盐水稀释后，搅拌下逐滴加入酶溶液中。室温反应3h。

(4) 加入一定量的终止液（0.2M赖氨酸），混匀后，室温终止2小时。

(5)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。

(6) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

(8)将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后, 10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等体积的甘油，混匀后-20℃保存。

注意事项：

HRP常见的抑制剂有叠氮化钠、氰化物、L-胱氨酸、重铬酸盐、羟胺类物质、钒酸酯、P-氨基苯甲酸和Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+等一些金属离子。