你以为的测序只是测序？看这篇测序详解（测序初级入门）

提到测序，我们会想到什么呢？

Sanger测序还是Illumina测序还是华大测序呢，又或者是pacbio或者nanopore？测序可能在我们日常研究课题中非常常见，但是关于测序的入门知识，咱们是否都清楚呢？今天学姐整理了一些关于测序的入门级别知识科普，希望学弟学妹们通过这篇内容能清晰的知道测序的差别。
1、Sanger测序、Illumina测序、华大测序以及pacbio和nanopore测序的差别？

Sanger测序成为一代测序，测序读长通常为800 bp/次，价格大约10元/次，测序时间大概需要1-2天;

Illumina测序和华大MGI测序都是二代测序，在中国大环境下，通常测序读长为双端150 bp（每次测序单次读长为150 bp，但是会正向读取150 bp，反向读取150 bp，因而测序片段的最佳大小为300 bp），价格约为Illumina 20元/Gb，MGI 10元/Gb，测序时间不等，最快一天，最长3天;

Pacbio和nanopore通常称为三代测序，测序读长从40 kb到4 M不等/次，三代测序价格差别较大，几千到几万都有可能，看物种基因组大小以及测序类型（de novo或者direct RNA等等），测序时间一般几小时即可完成。

至于测序原理的差异，大家有兴趣自觉补课吧

2、选择一代/二代/三代测序的原则是什么？

如果我们是PCR产物，而且只有几条产物，那么选择一代测序就行（为啥，因为价格便宜。）

如果是需要进行重测序或者RNA测序，那么大多会选择二代测序（还是因为价格便宜）。

如果是PCR产物非常多，或者需要质粒的全长序列，那么二代或者三代测序，看价格选择即可（通常几百元就能搞定）。

如果需要抢时间或者需要做de novo拼接，那么建议测三代。（还是价格便宜么？那肯定不是的，哪那么多便宜占）

3、如果需要二代或者三代测序，怎么开展？

墙裂建议初入门测序的同学们，选择试剂盒厂家购买成品试剂盒即可，很多文献里的建库步骤，现在已经几乎都有了成熟且简单的操作流程，无需我们各种酶体系搭配整的晕乎乎。

需要测序，就选择对应的建库试剂盒以及建库接头即可，按照说明书操作，妥妥的化身建库大神，信手拈来。

4、什么是测序接头？

测序接头是一种为了满足测序仪而准备的序列，一端连接待测序序列，一端连接测序芯片让机器能够识别并开始测序。

测序接头通常包含：测序芯片识别序列、index（区分样本）、index测序引物以及插入序列测序引物。不同的测序平台，测序芯片识别序列、index测序引物以及插入序列测序引物会有差异。

5、一种接头只对应一种测序仪么？

原则上一种接头对应一种测序仪，比如illumina接头只适配illumina测序仪，MGI接头只适配MGI测序仪。

但是也有例外，因为现在测序接头通用的声音越来越多，聪明的人类想到了将接头磷酸化已既适配illumina又适配MGI平台。

另外，不同平台的接头，通过index的组合不同，来区分测序仪上同时测序的样本。

6、barcode是啥？

barcode即index，illumina平台一般称为index，MGI平台称为barcode。

7、标签跳跃是什么？

从A文库不小心混到了B文库上后，黏连到B文库上，被进行扩增后，放大了错误的标签信号。

8、高GC区域测序，哪个测序平台更好？

目前大家都差不多，都有些问题。

9、测序选择Illumina还是MGI，哪种好？

测序效果一样，看个人选择。

10、不同公司的测序结果，能合并一起分析么？

Illumina和MGI可以合并没关系，但是同一项目不建议分测序平台，最好在分析前先做批次校正Combat后，再合并分析。

同一公司送样，也需要批次校正，因为用的试剂盒也不一样。涉及到定性，可以不用批次验证，但是如果需要定量，那么需要批次验证。

Pacbio和nanopore不能合并。

11、MGI环化会受到影响，但是什么区域会影响环化效率？

环化成功率低是MGI的缺陷，大片段（超过1kb等）环化成功率低，其他影响因素不确定。

12、测序数据量怎么确定？

线粒体、叶绿体、质粒等小的DNA，一般测3代，动植物大基因组，一般60-100x，微生物一般也测三代，基因组太小。

转录组测序深度要求20 M的reads paried，6G左右，像小麦一般测10-12G。

13、raw data和clean data的差异？

Raw data一般指下机数据，clean data一般指过滤掉低测序质量的数据。

14、测序时，不同的文库扩增效率和GC含量不同，会影响测序结果？

GC含量过高、过低，扩增效率都会低，与PCR扩增时，退火温度等都有关。代表性的是昆虫线粒体，有一段AT富集区，正常PCR扩增时，完全测不到。

15、公司测序数据如何判断数据好坏？

根据数据质量值Q20、Q30，一般至少需要大于90。

16、测序模式如何选择？

首选，常规文库，国内一般选择PE150，测序价格最便宜，只有一些单细胞、扩增子等测序策略有差别。

17、为什么不同的文库，测序深度不同？

因测序长度的限制，DNA测序时，是有可能在某些位置上没有覆盖到，这时，需要加大测序深度以减少未测到区域的概率。不同的文库，生信分析时，要求的片段区域的覆盖度不一样。

18、测序时，有没有可能遗漏了测序区域

测序量低，就可能出现。

关于测序相关内容，大家还想了解什么呢？把想知道的留言，下期可能就更新相关内容啦~