cfDNA 提取存在哪些挑战？

循环游离DNA（cfDNA）是由细胞释放到血液中的降解的DNA分子。正常生理情况下，cfDNA主要来源于衰老凋亡细胞基因组DNA的降解，当机体发生疾病时，如恶性肿瘤、外伤、器官移植排异、组织器官衰竭和感染重大疾病等，异常坏死细胞会释放大量DNA进入血液循环。血液中含量可以说是痕量的 cfDNA，在临床研究的不断积累与支撑之下，已广泛用于液体活检、无创产前筛查（NIPT）、用药指导、以及感染性疾病诊断等领域。ctDNA检测是目前市场上最常见的液体活检形式，它在具备巨大潜力的同时，在检测开发和临床应用的推广方面也面对着一系列挑战。本文将主要分析cfDNA 在提取过程存在困难和挑战。

一、样本特性方面

• cfDNA含量极低：在血液等体液样本中，cfDNA通常以极低的浓度存在。例如，在健康人的外周血中，cfDNA浓度可能只有几纳克每毫升（ng/mL），相较于细胞内的基因组DNA，其含量相差几个数量级。这使得在提取过程中要获取足够量用于后续检测（如基因测序、甲基化分析等）的cfDNA极具挑战性。大量的起始样本量虽然可以一定程度上解决这个问题，但这可能会受到样本获取困难（比如某些珍稀样本或者患者难以提供大量血液）的限制。

• cfDNA片段短小：cfDNA片段长度较短，通常在160 - 180bp左右，且呈现出明显的片段化特征。这些短片段在提取过程中容易受到物理和化学因素的影响而断裂或者降解。例如，在样本处理过程中，如果操作过于剧烈（如高速离心、过度振荡），cfDNA的完整性就会遭到破坏。而且由于其片段短小，在与提取试剂结合以及后续的分离纯化过程中，更难以像长片段DNA那样有效操作。

二、样本处理过程中的干扰因素

• 血细胞成分的干扰：血液样本是cfDNA提取的主要来源之一，其中红细胞、白细胞和血小板等成分会对提取产生干扰。红细胞破裂后会释放出大量的血红蛋白，血红蛋白中的铁离子等成分会对核酸提取过程中的酶（如聚合酶）产生抑制作用，并且可能会干扰后续的检测反应。白细胞破裂会释放大量的基因组DNA，这些gDNA会与cfDNA混合在一起，由于gDNA的量远远多于cfDNA，如果不能有效分离，会掩盖cfDNA的信号，影响检测结果的准确性。

• 蛋白质和其他杂质的影响：样本中除了血细胞成分，还含有大量的蛋白质（如血浆蛋白）、脂质、糖类等杂质。这些杂质可能会与cfDNA相互作用，影响cfDNA与提取试剂的结合。例如，一些蛋白质可能会和cfDNA形成复合物，在提取过程中一起被沉淀或者吸附，从而降低cfDNA的纯度。而且在洗涤步骤中，如果不能有效去除这些杂质，它们会残留在cfDNA样本中，对后续的分子生物学实验产生干扰，如抑制PCR反应中的引物退火或者酶的活性。

三、提取方法的限制

• 提取效率问题：目前的cfDNA提取方法在效率上仍有待提高。传统的酚 - 氯仿提取法虽然可以提取核酸，但对于cfDNA这种微量、易降解的核酸来说，操作过程复杂且容易导至DNA损失。磁珠法虽然有较高的特异性和回收率，但不同品牌和型号的磁珠对cfDNA的吸附能力差异较大，而且磁珠法的操作条件（如缓冲液的pH值、离子强度、磁珠与样本的比例等）需要精细控制，否则会影响提取效率。

• 方法的特异性不足：理想的cfDNA提取方法应该能够特异性地提取cfDNA，而不受到gDNA和其他杂质核酸的干扰。然而，现有的许多方法在这方面还不够完善。例如，一些基于离心柱的提取方法，在吸附核酸的过程中，不能很好地区分cfDNA和gDNA，导至提取后的样本中gDNA污染较为严重。而且部分提取试剂可能会非特异性地吸附一些RNA或者其他小分子核酸，也会影响cfDNA的纯度和质量。

• 自动化程度与成本的平衡：随着临床和科研对cfDNA检测需求的增加，提取过程的自动化变得越来越重要。但是，实现自动化提取cfDNA需要复杂的仪器设备和专门的试剂，这会导至成本大幅增加。而且目前的自动化提取设备在处理不同类型样本或者适应不同提取方法时的灵活性有限。一些小型实验室或者资源有限的医疗机构可能无法承担高昂的设备和试剂成本，同时也难以操作复杂的自动化系统。

四、保存和运输条件的挑战

• cfDNA的降解风险：cfDNA在样本采集后，如果保存条件不当，很容易发生降解。温度是一个关键因素，高温会加速cfDNA的酶解和化学降解过程。即使在低温环境下，样本中的核酸酶仍然可能会对cfDNA产生作用。另外，样本在保存过程中的反复冻融也会导至cfDNA断裂和降解。例如，在一些多中心临床研究中，样本需要在不同的医疗机构采集后运输到中心实验室进行分析，如果没有合适的保存措施，cfDNA的质量会大打折扣。

• 运输过程的稳定性问题：在运输过程中，样本会受到震动、温度变化等多种因素的影响。为了保证cfDNA的稳定性，需要使用特殊的运输容器和保存介质。例如，需要使用干冰或者液氮来维持低温，同时样本容器要具备良好的密封性和抗震性。但是这些措施会增加运输成本和操作难度，而且在实际运输过程中，很难完全避免温度波动和物理碰撞等情况的发生。

cfDNA提取面临着样本自身特性、样本处理干扰、提取方法、保存和运输等多方面的挑战，需要在技术、试剂、设备和操作规范等多个领域不断改进和优化，以提高cfDNA提取的质量和效率。