杂交捕获法建库的具体流程：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加、接头连接与纯化、预文库扩增与纯化、预文库定量、探针杂交、捕获、洗脱、文库扩增与纯化、文库质检。在上一篇《NGS检测流程--杂交捕获法建库（上）》中，详细介绍了预文库构建每个步骤的原理与注意事项。 本文将详细解析探针杂交之后每个步骤的原理与注意事项，帮助NGS技术人员更好地理解相关理论知识，以优化实验流程并提升数据质量。 01 杂交捕获法建库原理及注意事项| 步骤 | 原理 | 注意事项 | | 探针杂交 | 文库均一化：通常根据测序平台的要求，计算出每个文库的总投入量，用移液器精确取出每个文库所需体积至EP管内，使得混合后每个文库的投入量保持一致。此外，也可以根据测定的文库浓度，直接稀释高浓度文库，使其与低浓度文库达到相同浓度。然后从每个文库中取相同体积的稀释文库进行混合，确保文库总量一致。 减少非特异性杂交：Human Cot DNA主要用于减少重复序列的非特异性杂交；Blocker主要用于封闭接头序列，防止接头与探针发生非特异性结合。具体作用机制详见下文。 杂交反应：探针是一段设计好的寡核苷酸序列，与目标DNA中的靶序列通过碱基互补配对原则形成双链。
| 探针与目标序列杂交前需进行预变性，一般预变性的条件是95°C-98°C 30s-5min，对于GC含量较高的序列，温度可稍微提高，时间稍微延长，以确保双链的完全解链。 杂交反应的温度范围通常为50°C到70°C之间。温度较高时，可以减少非特异性杂交，因为较高的温度会解开弱的、不完全配对的氢键，使探针只能与目标序列中完全互补的靶位点结合。温度过高会导至探针和目标DNA片段解离，抑制杂交反应的发生。温度过低时，虽然反应效率较高，但可能会导至非特异性结合。所以一旦进入杂交反应，须严格控制杂交温度，以免造成非特异性结合，或者抑制杂交反应，影响杂交效率。
| | 捕获 | | | | 洗脱 | | 洗脱步骤通常需要多次洗涤：
（1）此步骤通常需要维持杂交捕获所需的温度，洗涤液1通常是高盐缓冲液，在高盐、高温条件下，非特异性结合的DNA链容易解离，通过磁力架吸附作用，未结合在磁珠上的DNA和从磁珠上解离的非特异性结合的DNA被去除； （2）洗涤液2通常是中等浓度盐溶液，在杂交捕获的温度条件下，进一步去除非特异性结合的DNA； （3）经过2次洗涤后，基本去除未结合的DNA和非特应性结合DNA，此时可室温条件下，用洗涤液3（通常是低盐或无盐的缓冲液）进一步去除游离出来附着在磁珠表面的非特应性DNA； （4）室温下用洗涤液4（通常是纯化的水或含有少量Tris缓冲液的水溶液）去除前面洗涤步骤中残留的洗涤剂、盐类等杂质。 洗脱温度须严格控制：较高的温度（通常是杂交捕获温度）能破坏不稳定的双链结构，使得非特异性结合的文库片段从磁珠上被洗掉，而靶标DNA与探针的结合仍然较为稳定。因此前2步洗脱若温度达不到要求，会降低捕获率。
| | 文库扩增与纯化 | 原理：基本原理同预文库扩增与纯化。区别是，预文库扩增的特应性引物设计含有adapter序列和可以区分各个样本的Index序列，每个样本用一对引物。此步骤的引物通常只需设计含有和adapter序列互补的序列即可。 扩增循环数设置： （1）对于高质量的DNA样本，如新鲜样本或较少降解的样本，通常可以减少PCR循环数。这样可以避免过度扩增，减少引入PCR偏差。
（2）对于降解较严重或DNA质量较低的样本（如FFPE样本），建议适当增加循环数以确保足够的文库量。 （3）小Panel（如50个靶标以内）：文库较小时，靶标数量少，扩增效率通常较高，PCR循环数可以适当减少，以避免过度扩增引入的偏差。 （4）大Panel（如数百至上千靶标）： 靶标较多时，由于捕获效率较低或均匀性不够，可能需要增加循环数，确保文库量足够用于后续测序。 （5）文库总量充足：如果初始文库量足够，可以使用较少的PCR循环，通常在8-11个循环即可获得充足的文库用于测序。（6）文库总量较低：如果混合文库的总量较少，为了保证测序所需的文库量，可能需要增加到12-16个循环。 （7）杂交时间较短时，捕获效率可能较低，需要增加PCR循环数来弥补较少的捕获文库量。
| 文库扩增引物通常包括如下序列： （1）含P5接头的引物结合位点的序列，用于扩增文库的5'端，确保扩增文库的5'端能够被测序仪识别。 （2）含P7接头的引物结合位点序列：同样，P7端的引物结合位点用于扩增文库的3'端。 在面对不同类型的样本和Panel时，实验室通常需要根据文库产出和均一性，结合实验条件逐步优化终文库的扩增循环数，避免一刀切的标准。
| | 文库质检 | | 在进行片段分析时需注意以下问题： DNA浓度：样品浓度过高或过低都会影响检测结果。通常需要对样品进行适当的稀释，以便得到清晰的片段峰图。 芯片或毛细管加载：使用Bioanalyzer时需要正确加载芯片，确保样品分配均匀且无气泡。Qsep则使用毛细管电泳，在上样时也要确保没有气泡和堵塞。 电泳运行时间：设置的运行时间要根据文库片段的大小进行调整，过长或过短都会影响分离效果。 对比标准：使用内标梯子（size marker）进行校准，确保测量片段大小准确。 电泳图谱：图谱中的片段峰值和其分布情况应符合实验要求的片段大小区间，通常测序文库的大小在300-500 bp。异常的峰值（如不符合预期的大片段或小片段过多）提示文库质量有问题，需要重新纯化或进行重新建库。
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02 相关基础知识
2.1 Human Cot DNA 的作用机制 Human Cot DNA 是一种来自人类基因组的重复序列，通常含有丰富的高度重复序列（如Alu、LINE元件等）。在杂交捕获过程中，文库中的这些重复序列可能与捕获探针发生非特异性的结合，导至杂交效率下降，产生大量背景信号。加入Human Cot DNA的目的是：与文库中的重复序列竞争结合，减少重复序列的干扰：因为Human Cot DNA 与文库中的重复序列互补度高，在杂交反应中会优先与文库中的重复序列结合，阻止这些重复序列与捕获探针发生非特异性杂交，从而提高杂交的特异性，从而提高目标区域的捕获效率。2.2 Blocker 的作用机制Blocker 是专门设计用来阻止接头序列与捕获探针发生非特异性结合的封闭剂。在文库构建过程中，为了便于后续PCR扩增和测序，插入片段两端通常会加上接头。这些接头序列有时也会与捕获探针发生非特异性结合，影响杂交捕获的准确性。Blocker 的作用是：封闭接头序列，提高捕获效率：Blocker 与文库中的接头序列互补，通过与接头序列配对形成双链，阻止接头序列与捕获探针的杂交，确保捕获探针更多地与文库中的目标区域发生杂交，从而减少非特异性信号。
2.2 碱基互补配对原则（Complementary Base Pairing）：是DNA和RNA分子中的一种特定的碱基配对规则，基于核苷酸的化学结构，碱基之间通过氢键形成特异性结合。由于氢键的特异性，腺嘌呤和胸腺嘧啶（或尿嘧啶）之间的结合总是形成两个氢键，而鸟嘌呤和胞嘧啶之间的结合则形成三个氢键。因此，G和C配对更为稳定，因为它们之间的氢键比A和T（或A和U）多一条。这一原则是遗传信息复制、表达的基础。
2.3 生物分析仪工作原理：使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 或 Qsep 系列产品 进行文库片段分布分析的主要原理是基于微流体电泳技术，这种技术可以高效地分离和检测DNA片段的大小和浓度。 微流体电泳技术： 电泳分离：通过微流体通道中的电场，DNA片段根据大小不同以不同速度通过分离介质（凝胶或类似物质），从而实现分离。较小的DNA片段移动较快，较大的片段则较慢。 荧光标记检测：DNA分子在电泳过程中通过与染料结合，使得每个片段的信号可以通过荧光检测器检测到。Bioanalyzer 使用 SYBR Green 或 GelRed 等荧光染料，Qsep 系列使用类似的荧光染料，特异性标记DNA，荧光信号的强弱与DNA浓度成正比。
片段分布分析：
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作者简介：涓涓细流，一个想要为NGS检验工作人员做点事的人，希望以此提高大家的专业水平，降低检验质量事故发生的概率，为患者服务。纤纤不绝薄成林，涓涓不止江河生！
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