NGS检测流程--杂交捕获法建库（上）

2024-11-14 13:41| 编辑: 归去来兮| 查看: 141| 评论: 0|来源: Precision Medicine Center

摘要: 本文将详细解析预文库构建的每个步骤的原理与注意事项

在上一篇《NGS文库构建--杂交捕获法和多重PCR法概述》中，简单介绍了杂交捕获法和多重PCR法的原理、优缺点及应用场景。杂交捕获法因其在目标区域的高精度捕获和广泛的应用领域，尤其适用于复杂基因组的研究，已成为实验室常用的建库方法之一。

杂交捕获法建库的具体流程：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加、接头连接与纯化、预文库扩增与纯化、预文库定量、探针杂交、捕获、热洗脱、文库扩增与纯化、文库质检。本文将详细解析预文库构建的每个步骤的原理与注意事项，帮助NGS技术人员更好地理解相关理论知识，以优化实验流程并提升数据质量。

**杂交捕获法建库原理及注意事项**
步骤	原理	注意事项
DNA 片段化/末端修复/dA尾添加	DNA片段化：使用特定的核酸酶将长片段DNA切割成较小的片段，通常在200-500 bp之间。末端修复：片段化后的DNA通常有不平整的末端（即5'突出或3'突出），这会影响后续的连接反应。因此，末端修复酶（通常是Klenow片段）会作用于片段化后的DNA，填补缺口或切除多余的碱基，使其末端变为平端。这一步通过DNA聚合酶填补5'突出链、通过核酸酶去除3'突出链来完成。加A尾：片段化和修复后末端是“平端”或“黏性末端”，需要通过一种特定的末端转移酶（通常是Taq DNA聚合酶）在其3'端加上一个单核苷酸dA（腺嘌呤），这是为了后续接头连接时与接头的T尾互补配对（接头通常具有dT残基）。	投入的DNA量会影响片段化效果，过少的DNA可能导至片段化不均匀，而过多的DNA则可能影响酶活性。核酸酶例如DNase I，可在25°C-37℃范围内工作，5-30min，将DNA切割成随机大小的片段。具体时间根据所需片段大小而定。一般时间越长，片段越短。为防止核酸酶在常温条件下进行DNA片段化，造成所得片段大小不受控制，配制反应体系时应在冰盒上操作。 Klenow片段是大肠杆菌DNA聚合酶I的一个片段，它保留了聚合酶的功能，但没有5'→3'的外切酶活性。Klenow片段对高温不耐受，通常在30°C以下使用。 Taq DNA聚合酶耐受温度为55°C-95°C，最适温度72°C。
接头连接与纯化	识别DNA末端：T4 DNA连接酶首先识别双链DNA的断裂位点，其中DNA片段末端具有3'羟基和5'磷酸基团。形成磷酸二酯键：T4 DNA连接酶将DNA片段3'端的羟基与5'端的磷酸基团结合，形成稳定的磷酸二酯键，从而将通用接头与DNA片段牢固连接起来。纯化：见下文。	反应条件设置：T4 DNA连接酶在4°C到25°C范围内都可以进行连接反应。通常，低温有利于长时间的高效连接，特别是对于较难连接的平端DNA片段。较高温度（如25°C）可以用于快速反应，但可能会降低连接效率，实验室可根据需求设置连接温度，一般20℃的连接温度较常用。为避免接头自连，尽量将连接酶与接头分开加入反应体系，严禁配制成预混液后再使用，严重影响连接效率。反应时间控制：反应时间通常设定为15分钟，时间过长可能会导至非特异性连接，过短则可能无法充分连接所有DNA片段。
预文库扩增与纯化	PCR扩增模板：接头连接和纯化后得到的文库产物作为扩增模板，含有目标DNA片段及其两端连接的测序接头。特异性扩增引物：引物是设计用于结合目标DNA片段两端的短链DNA片段，通常匹配连接接头的序列。引物的作用是为Taq聚合酶提供起始位点，以便在接头区域扩增DNA片段。扩增mix，通常包含Taq DNA聚合酶、dNTP（脱氧核苷酸三磷酸，DNA合成的原料）以及Mg²⁺离子（聚合酶的辅助因子）。其中，Taq DNA聚合酶是耐高温的酶，可以在PCR循环中的高温下保持活性，用于合成新的DNA链。	模板DNA量：投入DNA量的控制直接影响到扩增的效果。如果投入过少，可能导至产量不足；过多则可能导至反应体系饱和或非特异性扩增增加。扩增引物的设计和纯度：引物的设计需要高度特异性，尤其是匹配接头区域的序列。低质量的引物可能导至非特异性扩增或扩增效率低下。循环数的控制：循环数过多可能导至PCR产物的累积过量，并增加扩增误差的风险；循环数过少则可能导至扩增不充分，影响文库的产量。反应体系的配制和操作：在配制和处理PCR体系时，始终在冰上进行操作，确保反应组分的稳定性并避免DNA聚合酶的非特异性活性。
预文库定量	文库定量通常基于双链DNA（dsDNA）荧光染料技术。染料与双链DNA结合后，发出荧光信号，荧光强度与DNA浓度成正比。常用的设备是Qubit荧光定量仪，其原理是通过荧光染料的特异性结合来精确检测低至pg级别的DNA浓度。	DNA浓度的波动：文库浓度与核酸投入量、扩增的循环数和文库的构建质量密切相关。如果文库浓度偏低，可能是起始材料不足或扩增效率低。反之，如果文库浓度过高，可能提示PCR扩增循环数过多，增加了重复序列的比例。 Qubit操作细节：在Qubit定量时，确保样品和染料充分混匀，并且确保取样量准确，以获得准确的定量结果。在NGS文库构建过程中，精确的文库浓度定量是后续测序成功的关键。

02 建库过程操作常识

2.1 涡旋振荡：通过振荡可以确保反应体系中的试剂均匀混合，避免试剂浓度不均影响反应效果。

2.2 瞬时离心：通过短暂离心，反应体系可以集中到底部，避免试剂挂壁，确保所有成分参与反应。

2.3热盖 105℃：热盖通过维持较高温度来防止反应管内液体的蒸发，确保反应液体体积不变。

2.4 各个反应体系中Buffer的作用：提供反应所需的最佳反应条件。

2.5 纯化磁珠与反应液体积比例设置

（1）原理：不同的磁珠与反应液的体积比例会选择性地结合特定大小的DNA片段，磁珠纯化利用PEG（聚乙二醇）和NaCl的溶液，DNA在高盐和PEG存在下与磁珠表面结合。长片段DNA更容易在较低PEG浓度下与磁珠结合，而短片段则需要较高的PEG浓度。

（2）常见的纯化磁珠与反应液体积比例对应的DNA片段大小的回收情况表：

磁珠与反应液体积比例	回收的DNA片段大小
0.5倍	≥600bp
0.6倍	≥500bp
0.7倍	≥400bp
0.8倍	≥300bp
0.9倍	≥200bp
1.0倍	所有片段（≥100bp）
1.5倍	小于100bp（多为短片段）

2.6 连接或者扩增产物纯化（与核酸提取的洗涤步骤原理相同，有需要可回看文章《NGS检测流程--核酸提取》）

（1）DNA吸附：DNA通过高盐溶液结合与磁珠表面，磁力架通过磁力将磁珠吸附在管壁，使得未结合的杂质留在上清液中，这些杂质包括盐、未结合的接头等。通过去上清液，可以有效去除杂质。

（2）80%乙醇漂洗：乙醇是一种极性较低的溶剂，能在不溶解DNA的情况下有效洗掉多余的盐分、蛋白质和小分子杂质。高浓度乙醇的环境下，DNA仍能紧密结合在磁珠表面，而盐类杂质则容易溶解在乙醇中被洗掉。

（3）DNA洗脱：通常使用无核酸酶水洗脱。

注意：

尽量晾干残留乙醇（磁珠表面无反光、无开裂）：避免残留的乙醇影响后续的洗脱步骤，因为乙醇的残留会降低DNA的溶解性。
80%乙醇须现配现用：因为乙醇易挥发，浓度越低，DNA损失越多，DNA易溶于水。

2.7 PCR扩增条件设置：

（1）变性（Denaturation）：使DNA双链分开，为引物结合单链模板提供条件。常用温度：94°C-98°C，一般在94°C-95°C，大多数双链DNA在这个温度下可以完全分离，如果模板DNA较难变性（如GC含量较高的序列），可以适当提高到96°C-98°C。时间：20秒-1分钟，常用20秒-30秒即可。如果DNA模板较长或难变性，可以适当延长到1分钟左右。

（2）退火（Annealing）：引物与模板DNA结合，为DNA聚合酶延伸提供启动点。温度：Tm-5°C左右，退火温度取决于引物的Tm值（熔解温度），即引物与模板DNA结合时的解链温度。一般将退火温度设置为比引物的Tm值低5°C左右，如果温度过低，可能导至引物非特异性结合；如果温度过高，则引物可能无法有效结合。常用温度：50°C-65°C，短引物的退火温度一般较低，长引物或GC含量高的引物退火温度较高。时间：20秒-1分钟，一般20秒-30秒即可，时间太长容易产生非特异性扩增，时间太短则可能引物未充分结合。

（3）延伸（Extension/Elongation）：DNA聚合酶从引物开始合成新链，延伸DNA。温度：72°C（Taq DNA聚合酶的最适延伸温度为72°C，因此常用该温度进行延伸）。如果使用不同的DNA聚合酶，延伸温度可能略有变化，如Pfu酶、Q5等高保真酶的延伸温度可以设置在68°C - 72°C。时间：30秒 - 1分，每1000 bp DNA片段的延伸通常需要30秒到1分钟。如果目标片段较长（如>2 kb），可以延长延伸时间。对于短片段，30秒一般已经足够。

（4）循环数：一般PCR的循环数根据投入DNA的量决定。如果循环数过多，可能产生非特异性扩增和背景噪音；循环数过少，则目标DNA扩增量不足。

（5）最终延伸（Final Extension）：72°C，5-10分钟：为了确保所有DNA片段的合成完全，尤其是末端引物的延伸，一般在最后一个循环后设置一个5-10分钟的延伸步骤。

2.8 Qubit定量法：

（1）原理：Qubit定量使用的荧光染料与双链DNA具有高度的选择性。这些染料在与双链DNA结合后，才会发出荧光。Qubit的几种不同的试剂盒（如dsDNA HS Assay Kit和dsDNA BR Assay Kit）包含适合于特定浓度范围的染料和缓冲液。

当染料结合到文库中的双链DNA后，在特定波长的激发光下，染料会发出荧光。荧光的强度与双链DNA的浓度成正比。Qubit荧光定量仪能够通过荧光信号的强度来推算样品中的双链DNA浓度。

在进行定量时，Qubit荧光定量仪需要先进行标准品校准。通常，用户会将两个已知浓度的标准品（标准1和标准2）与Qubit染料混合，仪器通过检测这两个标准品的荧光信号来生成一条标准曲线。根据这条标准曲线，Qubit能够将样本的荧光信号转换为精确的浓度值。

（2）与NanoDrop相比：Qubit比NanoDrop更为灵敏，尤其是对低浓度样本的检测。NanoDrop使用的是吸光度原理，容易受到盐类、蛋白质等杂质的干扰，而Qubit则因荧光染料的选择性，使其定量结果更加准确。

下一篇文章将继续介绍杂交捕获法建库后续操作背后的科学原理与注意事项。敬请关注！

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作者简介：涓涓细流，一个想要为NGS检验工作人员做点事的人，希望以此提高大家的专业水平，减少检验质量事故发生的概率，为患者服务。纤纤不绝薄成林，涓涓不止江河生！

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