你可曾留意过“微流控”技术？在测序界，它悄无声息，却似乎无处不在。 它就像是金庸笔下的扫地僧。看似年迈体衰，实则出手了得。末了一手提起一个萧峰/慕容复的爹，深藏身与名。 > 芯片实验室 Lab on a chip 先前提过，二代测序（Next generation sequencing, NGS）也叫高通量测序，发展目标是“更高通量、更低成本”。而高通量，也是微流控的主要特征之一。 微流控（Microfluidics）指的是在集成化微米级通道中操控微量流体的科学与技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、材料、生物学和生物医学工程等学科领域的“杂学”。 它的发展可以追溯到1990年，Andreas Manz教授首次提出了微全分析系统（Miniaturized total chemical analysis systems, μ-TAS）。此时微流控以一种基于流动注射分析、色谱和电泳的化学分析技术的面目出现，顺应了分析系统的小型化趋势。 进入21世纪后，微流控的内涵和应用范围经历了极大的拓展，还催生了一个颇有科幻气息的概念，芯片实验室（Lab on a chip, LOC）。 LOC就是把原本一整个实验室才能完成的分析和实验，包括样品引入、前处理、生化反应和检测分析，微缩、集成到方寸大小的芯片上进行。相比之下，器官芯片（Organ on a chip）倒显得没那么大气了，像是退而求其次的产物。 能否用这个不足巴掌大小的微小芯片，托起人们对微流控未来图景的庞大期许，至今仍是未知数。但可以确定的是，微流控所经历的技术爆发阶段，为生物医学、药物开发、临床诊断等领域爆出了很多“装备”。基因测序不算最典型的，但也在无形之中受益良多。
从广义上来说，一切将生物/化学实验微型化的尝试，都和微流控搭点边。 为了实现高通量和低成本，NGS技术必然需要在微型化方面作文章。因此，从首个商品化NGS系统，即454测序仪身上，就能看出多重微流控的身影。 首先是Microwell芯片，被称作微坑、微井或微孔芯片，其实就是一种微型孔板。孔板是生物实验中经常用到的反应容器，但即使是1536孔板，每孔体积也有10微升左右，孔径在2～3 mm，未能进入微型化范畴。把尺寸进一步地减小，小到几微米至几百微米的水平，就是微流控技术领域中典型的Microwell型芯片了。 这类芯片可以用最基础的半导体加工技术来制作。将光胶作为牺牲层，先覆上掩模、进行光刻，形成图案以后，再利用光胶层的保护作用，对基底进行刻蚀。最后去除残留的光胶，得到微坑结构。 微流控领域还经常用到一种叫做“软光刻”（Soft lithography）的加工技术。用光胶首先在基底上加工出微柱结构，即微坑的反结构，作为模具。然后把一种高分子聚合物，聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）浇于其上，加热固化以后，再把它从模具上剥离，即得到PDMS微坑阵列芯片。这种方案中的微柱模具几乎可以永久性地使用，减少了繁琐的光刻和刻蚀步骤，简化了加工流程，但PDMS本身有一些缺点，一般只适合小作坊式的实验室使用。
454测序所采用的微坑尺寸也在微米级。它的加工方法就是古老的氢氟酸湿法刻蚀，只不过不是在普通的玻璃，而是切割成薄片的光纤上进行。 传统测序反应在离心管或孔板中开展，454测序反应则发生在体积约为84 pL的微坑之中。试剂省了，规模上去了，目标自然也就达到了。
不过，此类芯片缺乏微流控特色，只有“微”，几乎没有“流”和“控”。在微坑阵列芯片上均匀地铺上微球悬液，微球就会自己落入微坑。一个微球一个坑，只涉及到了微球自身的重力作用。 也因为“控制”的成分不多，简单易用，使用门槛低，当人们想用微流控相关技术来实现某种微型化生化分析时，最容易想到的便是微坑阵列芯片。例如，Gole等把这种芯片应用于单细胞全基因组扩增和测序分析，要早于液滴微流控系统在此类实验上的应用。浙大郭国骥团队发展了Microwell-seq，实现了大规模单细胞转录组测序和小鼠细胞图谱的构建。对于非微流控领域的研究人员来说，Microwell型芯片一般是首选。
Microwell-seq 随着454黯然落幕，Illumina强势登场，NGS测序芯片一度和微流控没什么关联。早期的流动槽除了泳道这种宏观结构以外，不具备精细的微纳结构。桥式扩增后形成的Cluster在泳道底面上是随机分布的，所以当时的Illumina测序还需要优化Cluster密度。如若密度太高，相邻的Cluster之间会相互重叠；密度太低则导至数据产出效率低下。 有趣的是，随后Illumina便推出了图案化流动槽（Patterned flow cell），其泳道中包含Nanowell阵列。Nanowell比Microwell更微小，单个Nanowell孔径大约为几百纳米。寡核苷酸引物被选择性地修饰在纳米井内，使扩增后形成的Cluster呈阵列化分布。Nanowell是什么样儿，那些Cluster就分布成什么样儿。 Nanowell对Cluster产生的空间限制，使Cluster的排列更规则，同时避免了Cluster重叠问题，让流动槽芯片实际能够达到的Cluster密度上了一个台阶。也就是说，此举进一步地提高了单位时间内的数据产量，提升了测序效率。
话又说回来，从芯片角度攀扯测序与微流控的关系总归是有些勉强，这方面它和半导体技术的联结可能更紧密，也更直接。 但是，我接下来提到的这个测序应用方向，就无论如何也绕不开“微流控”了。那就是—— 单细胞测序。 > 与单细胞测序难舍难分 如同单细胞测序是如今测序行业的一个分支，液滴微流控也是微流控技术的一大分支。 什么是液滴微流控技术呢？ 别急，我们先回到刚才提到的454测序，细数第二项微流控相关技术，乳液PCR。 乳液有水包油、油包水、油包水包油等各种类型，而乳液PCR通常是油包水型。油相中分散着无数微小的液滴（Droplets），让它整体呈现乳白色。 1998年，Tawfik和Griffiths在Nature Biotechnology上发表文章，首次以乳液的形式开展基因修饰与分子进化分析。他们认为，这种内含基因片段和反应物的小液滴与细胞本身相似，并称之为细胞样区室（Cell-like compartments）。细胞膜围裹细胞器和各类生物分子，类比到液滴上，就是油-水界面包裹着生化反应。 当时的乳液制作方法十分粗暴，就是搅拌。一边搅拌，一边往含有表面活性剂的矿物油中倒入DNA与试剂的混合溶液，这样产生的液滴尺寸很不均匀。 2001年，Quake研究组利用T型微通道生成尺寸均一的液滴，这才与微流控之间产生了现实与命运的交织。
T-junction 乳液PCR有什么好处呢？这得从液滴微反应器的特征说起。 与前面提到的微坑阵列相似，液滴其实也是一种微型反应容器。它是柔性的，既可以是静态的，也可以是流动的。不同于微坑的固相容器壁，液滴与油相之间的球状界面就是天然的液体屏障，能够避免液滴中的成分外泄，使每个液滴都是独立的微反应器（Microreactor）。 天下武功，唯快不破。生成液滴的过程往往非常快速，适于开展大规模、高通量生化分析。
对于PCR而言，当液滴足够地多，模板DNA被稀释到一定程度时，就能让每个液滴里最多只含有一条DNA分子。于是，在每个液滴围拢成的微型世界里，所有的资源都向这个唯一的DNA倾斜，不存在恶性竞争，整体的扩增情况就更为均匀。进一步地把乳液PCR升级为数字PCR，还能实现核酸分子的绝对定量。 同样的原理也适用于单细胞捕获。稀释细胞悬液，使其生成液滴，细胞便会在液滴里随机分布。如果控制得好，部分液滴能恰好捕获到一个细胞。现在主流的单细胞测序系统很多都是这个路数。 2015年，同一期Cell杂志上发表了两篇文章，均采用了液滴微流控技术来实现单细胞转录组分析，叫做inDrop和Drop-seq，并且都有液滴微流控大佬David A. Weitz的参与。 这位Weitz教授在2007年就把液滴微流控技术玩出了花儿——利用同轴共流型的微流控通道，制作“乳液中的乳液”，包括油包水包油（Oil-in-water-in-oil）型和油包水包油包水（Water-in-oil-in-water-in-oil）型的多重液滴，并且可以将液滴尺寸控制得非常均匀。
液滴中的液滴中的液滴 A drop within a drop within a drop Drop-seq、inDrop还有10X Genomics的Chromium系统采用十字型微流控通道，利用油相对水相溶液的切割作用（两者方向垂直）生成液滴，同时将单细胞包裹其中。每小时生成的液滴数量达到几百万个。 这三个系统的相似之处不止于此。它们还都采取了单微球单细胞共捕获策略，通过把DNA序列固定在微球上，再将微球和细胞一对一地包裹于液滴之中，实现细胞编码和分子标记。 微球上修饰的DNA序列也非常相似，包括了细胞编码序列、独特分子标识符（UMI）、PCR引物序列和poly-T。其中，UMI相当于是每条RNA的“身份证”。一旦拴上UMI，所有RNA分子就能汇拢起来，统一处理，数据分析时再根据UMI进行拆分。 如今，以10X Genomics为代表的基于液滴微流控技术的单细胞测序系统占据了市场的主导地位。 > 出走多年，归来仍是奢侈品 香奈儿公司曾与Weitz教授合作，推出了基于液滴微流控技术的山茶花保湿精华露（HYDRA BEAUTY Micro）等一系列护肤品。其中的活性成分以液滴的形式存在，据说那些无数的微小的液滴在皮肤上爆裂时，会产生一种普通乳液所无法比拟的细腻、水润的感官体验。
这项不同寻常的商业合作，给微流控染上了一丝奢侈品的气氛：昂贵，花哨，实用性存疑。 作为商业上成功的范例，10X Genomics的Chromium系统仅提供了液滴式文库构建的功能，但价格一直居高不下。测序服务公司所提供的10X Genomics单细胞测序服务，号称单个细胞的均摊成本不高，但谁会只做两三个单细胞呢？几百或几千个单细胞起步，做一组数据动辄几万几十万。单细胞领域成了学术“财阀”的竞技场。 高成本、高使用门槛一度是微流控技术产业化之路上的绊脚石。就连在科研界，许多生物医学类实验室也对微流控望而却步。业内人士则变着花样地发展简单好用的技术，比如离心式的快速液滴生成方法。 有一个词经常出现，“Microfluidics-free”，发展微流控技术，竟以摆脱微流控的束缚为目标，这反映了相关研究人员的困扰：要怎么样才能既实现微流控的功能，又避开微流控芯片加工贵、使用难的问题呢？ 如果说，降成本是所有技术进入市场化进程后永恒的命题，那么，微流控技术还存在特殊的困境。 微流控芯片或许解决了生化实验中的核心问题，实现了微型化和高通量，但在大多数情况下，光有它是远远不够的，还需要辅之以光、机、电系统。于是乎，从一开始只是研发一块小小的芯片，发展到最后竟演变成开发一台完整的仪器，令人忍不住发出《红楼梦》中刘姥姥吃茄鲞时的感慨： “我的佛祖！倒得十来只鸡来配他，怪道这个味儿！” 微流控究竟是花拳绣腿，还是真正地武力高强，追根究底，还取决于它是否合时宜、逢地利、得人和。它本身仅仅是一种武器，或是一本武林秘籍罢了。至于结果如何，那就是“他强由他强，清风拂山岗；他弱任他弱，拳脚身后过”了。 |
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