免疫分析的基础原理与方法

抗原和抗体结合发生的免疫反应具有亲和性和特异性，该反应不是化学反应，而是非共价键的相互作用，主要包括疏水力、静电引力、范德瓦耳斯力和氢键作用力，这些力的相互作用发生在侧链或多肽链主干之间。

疏水力：抗原和抗体分子侧链上的某些氨基酸是疏水性胶体，在水溶液中不会与水分子形成氢键，当抗原决定簇靠近抗体活性结合位点时，疏水性氨基酸可排斥水分子形成疏水力，促进二者之间的结合。

静电引力：抗原决定簇和抗体分子结构中都含有氨基端（带正电荷）和羧基端（带负电荷)，带有相反电荷的基团之间的静电引力作用促使抗原和抗体相互结合。

范德瓦耳斯力：分子与分子之间的作用力，其作用效果主要取决于分子的空间构型。

氢健作用力：指在具有亲水基团（如羟基、氨基、羧基）的抗体与相对应的抗原相互接近时形成相对微弱和可逆的氢键桥梁，促进抗原和抗体的结合，该作用力比范德瓦耳斯力的结合力强且更具有特异性。

抗原和抗体的结合遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学基本原理，平衡方程为：

式中，K为平衡常数，是反映抗原与抗体结合能力的指数，又常称为亲和常数，范围为10^6~10^12L/mol；k1为正反应速率常数：k2为负反应速率常数；[Ab-Ag]为抗体-抗原结合物的摩尔浓度；[Ab]和[Ag]分别为游离抗体或抗原的结合位点的摩尔浓度。

当抗原和抗体之间的亲和力较强时，形成的抗原抗体结合物的结合牢固，不易解离；反之，结合物较易解离。虽然抗体和抗原间的免疫反应是可逆的，但是在无外界因素的作用下，抗原-抗体结合物的自发解离通常非常缓慢，在含有表面活性剂的高浓度无机盐溶液中可以加速这一解离过程。

免疫分析是利用抗原与抗体之间高特异性的反应（即免疫反应）实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的方法。免疫分析方法分为竞争法和非竞争法，其中，竞争法包括直接竞争法和间接竞争法，非竞争法包括双抗体夹心法及抗原和抗体直接结合法。

1、间接竞争法

间接竞争法主要是针对半抗原的检测，因为常规的基于标记的免疫分析方法不适合检测小分子物质。该方法通常将抗原与蛋白质（如牛血清蛋白）的结合物固定在固相表面，待测液中游离的抗原与被固定的抗原竞争结合游离的过量抗体，移去溶液中的抗原-抗体结合物，标记二抗再与固相表面的抗体（已和被固定的抗原结合)结合。标记物可以是酶、荧光或其他用于信号放大的物质。

间接竞争法示意图

当样品中游离抗原的浓度较高时，与固相载体表面固定的抗原结合的抗体就越少，相应地与之结合的标记二抗就越少，标记物产生的响应信号（如电流）就越小，由此建立响应信号与目标抗原浓度之间的关系。该方法中一个抗体分子能同时结合多个二抗分子，使信号放大效果大大增强，提高检测的灵敏度。该方法包含的主要步骤包括抗原抗体温育、清洗、二抗温育、信号检测。

2、直接竞争法

直接竞争法既可以基于抗原（或抗原与蛋白质的结合物）的固定，也可以基于抗体的固定。在基于抗原的固定方式中，游离的抗原与被固定的抗原竞争结合标记抗体，经过清洗步骤后检测抗体标记物所引起的响应信号的变化。与间接竞争免疫法相比，该方法对抗体进行标记，减少了使用标记二抗结合的步骤，但同时，标记抗体的成本较高，且不如标记二抗的信号放大效果强。

同理，在基于抗体固定的方式中，游离的抗原和标记抗原竞争结合被固定的抗体，经过清洗步骤除去未结合的标记抗原。这种方法包含温育、清洗、信号检测三个主要步骤。该方法存在的问题在于，当目标抗原浓度较低时，参与竞争的标记抗原引起的信号响应相对很大，待测信号的变化很小，使得检测的灵敏度不高；另外，该方法中使用的标记物应避免对游离抗原亲和性的影响。

3、双抗体夹心法

双抗体夹心法是一种非竞争方法，需要一抗和二抗两种抗体。二抗只能与相应的抗原发生特异性结合，不能与一抗结合。样品中的抗原与固定在固相表面的抗体（即一抗）结合形成抗原-抗体结合物，经清洗后，标记二抗与抗原结合，形成“第一抗体-抗原-第二抗体”的双抗夹心结构，检测标记物产生的响应信号。

双抗体夹心法示意图

与竞争免疫分析模式相比，该方法需要固相抗体与标记二抗共同对目标抗原进行特异性识别，减少了非特异性结合带来的干扰，因此该方法的特异性和灵敏度更高，检测下限更低。该方法一般适用于检测生物大分子，小分子抗原由于没有足够的结合位点同时结合一抗和二抗，不适合采用该方法。

4、抗原和抗体直接结合法

直接结合的非竞争免疫分析方法将抗体或抗原固定在固相表面，待测抗原或抗体被捕获后引起响应信号的变化。该方法需要考虑非特异性吸附和背景干扰等问题。