IVD前沿 | RCA信号放大技术如何应用于单分子免疫检测

在固体表面部署DNA扩增反应具有通过高效复用等方式扩大DNA分析技术性能的潜力。此外，表面DNA扩增反应可能为适用于检测不同分析物的其他类型传感器模式和分析扩增策略打开了大门，包括无法直接扩增而通常只能通过免疫测定法检测的蛋白质。RCA能够产生密集的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)链，形成聚电解质刷层。

利用结合表面等离子体共振(SPR)和光波导光谱(OWS)的倏逝波光学生物传感器，在原位监测表面附着的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)链的生长。滚环扩增(RCA)促进ssDNA链的“支链”生长，并通过光学追踪锚固定在金传感器表面的ssDNA链的逐渐延长。

在足够的聚合物链密度下，ssDNA呈现出一个厚度超过10 μm的刷状结构，支持沿金属传感器表面传播的引导光波光谱。利用表面等离子体的受限光场和额外的离域介质光波导模式同时探测该界面，可以精确地原位测量ssDNA刷的厚度、聚合物体积含量和密度梯度。作者首次报道了利用SPR/OWS技术测量固体表面上的RCA速度，可以与散装溶液中的RCA速度进行比较。此外，还讨论了通过改变支链密度和离子强度以及通过与互补短ssDNA钉的亲和反应进行后处理来控制ssDNA刷的性能。这些观察结果可能为基于亲和力的生物传感器对RCA进行敏感和快速的检测提供重要的线索。

通过结合SPR和PEF方法，这项工作研究了RCA产生的长单链DNA (ssDNA)链的构象对等离子体传感器响应增强的影响。为了将RCA反应限制在瞬变表面等离子体场内，从而最大限度地提高传感器响应，开发了一个携带分析捕获分子和额外导向ssDNA链(与RCA生成链的重复片段互补)的界面。当使用圆形挂锁探针作为模型目标分析物时，PEF读数表明，与直接标记相比，报告的RCA实施将检测限(LOD)从13 pM提高到高fM浓度。相应的增强因子约为2个数量级，这与所开发的生物界面在瞬时表面等离子场中折叠的RCA链所附着的荧光团发射体的最大数量一致。此外，RCA可以通过荧光显微镜直观显示单个结合事件，从而可以直接计数捕获的分子。这种方法为单分子检测提供了一种快速的数字读出格式，进一步降低了LOD。

对人血清中低丰度蛋白分子的分析，其基础是对固体传感器表面上单个亲和捕获的分析物进行计数，从而产生类似于数字检测的读出格式。该方法采用滚动环扩增(RCA)的夹心免疫分析方法，通过将目标分析物与荧光显微镜观察到的空间上不同的亮点相结合，进行单分子检测(SMD)。目标分析物和其他免疫测定成分与传感器表面的非特异性相互作用在本工作中特别重要，因为它最终限制了该测定的性能。通过设计各自的生物界面和巯基自组装单层与寡聚乙烯(OEG)头部基团，以及聚[寡聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯](pHOEGMA)抗污聚合物刷用于在传感器表面固定捕获抗体(cAb)，使其最小化。结合表面等离子体共振和表面等离子体增强的荧光监测反应动力学，建立了基于RCA接枝的长单链DNA的荧光后标记的检测方法。这些技术被用于原位测量cAb与传感器表面的结合，短单链DNA标记到dAb，从分析的液体样品中捕获目标分析物，以及RCA产物的荧光读数。

通过调整抗污生物界面，优化共轭化学，以及实现dAb与传感器表面之间的弱库仑排斥，该方法的检测限(LOD)得到了大幅提高。对于所选的白细胞介素- 6生物标志物，对模型(加标)样本进行了SMD检测，LOD浓度为4.3 fM，并验证了对标准人血清样本的检测能力。

在固体传感器表面进行了三明治免疫RCA的实验，用于单分子水平的蛋白质分析物的检测。通过结合SPR和PEF装置，实时监测生物分子在表面的附着和长ssDNA链的RCA生长，并行测量表面质量密度变化和与荧光团标记分子结合到表面相关的荧光信号。这两种读出模式对发生在非常接近表面的变化很敏感，这是通过共振激发表面等离子体波的受限电磁场(到一个约100 nm的距离)来探测的。

RCA产物的存在表现为荧光强度增加，来源于Cy5-LS标记的ssDNA链与亲和捕获的IL-6分析物连接。成像显示，当目标IL-6分子从低(fM和低pM)浓度的溶液中被捕获时，可归因于单个扩增事件。对于较高的IL-6浓度c > 48 pM，表面可容纳未分离的明亮区域。应该注意的是，对传感器表面的单个IL-6分子进行成像的能力并不意味着报告的概念允许检测分析溶液中分析物的单个拷贝。