LAMP分子检测技术

LAMP分子检测是一种类似于荧光定量PCR的技术。但是LAMP检测比定量PCR更加简便，速度更快，价格很便宜，灵敏度高，特异性也高。

①LAMP的操作更加简便，只要有离心机和60°C恒温水浴就可以操作；

②LAMP的检测速度快，只需30分钟就可以完成检测反应；

③LAMP的检测成本很低，我查到网上售卖的LAMP检测试剂盒大约十几元人民币一个反应；

④LAMP检测的特异性和灵敏度都很高。

LAMP 是“Loop-mediated isothermal amplification”的首字母缩写。翻成中文，是“环介导等温扩增”的意思。

这项技术最早是由日本科学家Tsugunori Notomi在2000年首先提出。

这是一种比传统PCR更加容易操作的核酸扩增技术。它不需要热循环仪，只需要60～65 °C的恒温水浴就可以操作。

检测结果可以通过肉眼进行判断。

LAMP 实验中要用到 Bst DNA 聚合酶。它实际上天然 Bst DNA 聚合酶的大片段部分。Bst DNA 聚合酶大片段保留了天然 Bst DNA 聚合酶的一个重要的特点，就是在进行聚合反应时，它可把被复制的 DNA 双链中的那条非模板链推开。

之所以要用 Bst DNA 聚合酶的大片段，是因为这可以去掉天然 Bst DNA 聚合酶的小片段中所具有的 DNA 5’ 端外切酶和 3’ 端外切酶的酶活性。

另外，这个酶还可以在 65 °C 的较高温度条件下，在较长时间内保持酶活性。

这是 LAMP 的引物设计。

先看左侧，左侧设计有 2 个引物。先是 forward outer primer，翻译成中文就是“正向的外侧引物”。这个引物的序列是针对目标序列左边外侧的 F3C 序列的，这里 F 是 forward 的意思；3 是指第三段序列；C 是 complementary，“互补”的意思。

接下来，是 forward internal primer，翻成中文是“正向的内侧引物”。它的序列分成两段，其中 F2 段是与所针对的目标序列上的 F2C 段序列相互补的。它的另一段序列，是 F1C 序列，这段序列是与模板上的 F1C 序列是一样的。注意：它是与模板上的 F1C 序列一样，而不是与 F1C 序列互补。

再看右侧的 2 个引物。其实，右侧的两个引物与左侧的两个引物的设计是相似的，只不过方向倒过来。并且引物和引物所针对的目标模板序列的标识，都改成了“B”开头的，也就是 Backward，翻成中文是“反向”意思。

我在网上找到了一段说明 LAMP 实验原理的动画，这个动画很好地展示了LAMP的复制过程。

接下来，我们对这个动画进行逐段的解释。

先有一段要被扩增的目标 DNA，目标 DNA 的一端可以被分成三段，分别是：F1、F2、F3。而对应的互补链上的序列则是 F1C、F2C 和 F3C 。

设计好的“正向内侧引物”，结合到目标 DNA 的 F2C 这一段上。

然后，在 DNA 聚合酶的作用下，引物上发生延伸反应。延伸反应一直进行到目标序列的另一端。

接下来，回头来看合成反应起始的位置，“正向内侧引物”的尾巴是翘起来的。

留下的模板 DNA 链上 F3C 这一段序列的单链，于是正向外侧引物结合到模板单链上，同样在 DNA 聚合酶的作用下，正向外侧引物发生延伸反应。

在合成链的同时，之前被合成出来的第一条链，此时被聚合酶从模板链上推开。

我们来看这条被推开的链，一方面，它的一端内部就有互补回文序列，互补序列折叠起来，形成一个小环。

另一端，“反向内侧引物”结合到这条链上，并在聚合酶的作用下，发生延伸反应产生出第 3 条链。

同时延伸反应可以把之前折叠形成的小环推开。

然后，反向外侧引物结合到这条链上，也同时进行延伸反应，并把第 3 条链推开。

现在，我们来看这第 3 条链。它有一个显著的特点，就是它的两端都有互补回文序列。当它处于单链状态的时候，两端的互补回文序列都自然地折叠起来，在两端各形成一个小环。

这时候，F1 这一段序列是有一个游离的 3’ 尾巴的，它又结合到 F1C 序列上。这个 F1 序列就可以作为聚合酶的合成引物起作用。

同时左侧的 F2C 这一段，是可以被“正向内侧引物”所结合的，于是，链内部的 F1 序列，和结合上来的“正向内侧引物”，都在聚合酶的作用下，发生延伸反应。

注意：虽然发生了延伸反应，但这还是第 3 条链。

F1这段序列所延伸出来的这条链，被“正向内侧引物”所引导的合成反应所推开，形成单链。

有回纹序列的单链折叠回来，形成一个新的可延伸的末端，开始延伸反应。

我们回过来看第 3 条链。这个被延伸的第条 3 链，在此时有了 4 段中心模板序列，也就是 2 段粉色的序列和 2 段红色的序列，中间则有一个单链的鼓泡。

这个鼓泡会被反向的内侧引物结合上，并进行延伸反应。延伸反应会把下半条链推开，让下半条链形成单链。

这个单链末端的回文序列又引发新一轮的延伸。

延伸的结果是，一方面原来粘在上面的第 5 条链被推开，形成一条独立的单链。

另一方面，第 3 条链的长度进一步加倍，形成一条含有 8 段原始序列（4 段粉色，4 段红色）的长链。

这就是 LAMP 的复制过程。

一方面，在链的数量上进行扩增；另一方面，是链的长度上进行扩增。

总之，会形成一轮又一轮的指数扩增。

左图，就是经过指数扩增后，会形成的各种长度的扩增产物的示意图。

右图中，4号泳道，就是LAMP扩增产物的电泳结果。可以明显地看到，反应产物中有类似梯子状的扩增产物，也就是反应产生目标序列整数倍长度的扩增产物。

首先，LAMP 反应中，在 dNTP 被聚合酶合成进 DNA 链的同时，会有大量的焦磷酸被释放出来。

而高浓度的焦磷酸会和反应体系中的镁离子结合，形成沉淀。这种沉淀可以被浊度计检测出来。如果没有浊度计，离心之后，肉眼也可以看到白色沉淀。

第二类检测方法，是可以用染料的显色反应、或荧光反应来检测反应是否有发生。

Calcein，中文叫“钙黄绿素”，它是一种能与金属离子结合的荧光染料。如果有荧光仪，可以在紫外光的照射下，检测 365nm 处的荧光，有荧光的话，就是有 LAMP 反应发生；如果没有荧光，就没有 LAMP 反应发生。

如果没有荧光检测仪，也可以用肉眼观察。阳性反应，溶液呈绿色；阴性反应，溶液呈黄色。

目前，已经有大量基于 LAMP 检测原理的检测试剂盒上市。这些试剂盒的检测灵敏度，一般可以在 1～100 病毒/微升的样本中检出病毒。

因为 LAMP 反应要有 4 条引物共同作用识别 6 段特异序列，所以，只有样本 DNA 中同时有这 6 段特异序列，才会发生阳性反应。因此 LAMP 检测有很高的特异性。

有些公司把 LAMP 试剂盒进一步做成冻干粉剂，以方便运输、和储存，这极大地拓展了 LAMP 检测方法的应用范围。

如果加入逆转录酶，还可以检测 RNA 病毒。

因为 LAMP 方法的便宜、易用、高灵敏度、适应性强的特点，所以，现在 LAMP 方法已被广泛地用于农业、畜牧业中，用于检测植物或动物是否受到特定病原体的感染。