Cas12f能切割靶标双链DNA吗？

Virginijus Siksnys团队2020年在《Nucleic Acids Research》发表的文章PAM recognition by miniature CRISPR–Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage[1]。文章表明，Cas12f（旧称Cas14）不但能够靶向ssDNA[2]，而且也具有PAM依赖性靶向dsDNA的活性。这与前期Jennifer Doudna团队发现Cas12f只能切割靶标ssDNA的结论不同[2]。因此，Siksnys的工作不仅修正了我们之前对于Cas14家族切割靶标的认知，更为Cas14家族的使用提供了更广阔的前景。

大家熟悉的Cas9、Cas12、Cas13蛋白，它们的分子量都偏大，这对于将该系统递送入细胞是不利的，这可能会限制它们的某些应用。而该文所研究的Cas12f蛋白的分子量则普遍只有400~700 AA，几乎是最小的Cas9或Cas12蛋白的一半。

与Cas12a蛋白的比较可以发现，Cas12f主要差异位于蛋白的N端，Cas12f蛋白的N端明显要短了许多（图1）。由于这一差异，先前的研究认为其可能是V型CRISPR/Cas系统进化的残留物或中间体，可识别和剪切ssDNA，而不具备识别和剪切dsDNA的能力[2]。

图1.Cas14在蛋白N端比Cas9与Cas12短很多[1]

研究者使用了之前报道的方法[4]来寻找Cas12f所对应的PAM序列。他们首先构建了一个含7-bp随机PAM的质粒文库（图2），靶标的spacer长度取决于这些Cas12f系统在各自菌株中观察到的平均长度。接着，他们体外转录并纯化了这些Cas12f的sgRNA，sgRNA中的spacer长度暂定为20 nt。然后，他们在大肠杆菌中表达各种Cas12f蛋白，收菌后在含PMSF的lysis buffer中超声裂解，直接取裂解产物的上清，加入RNase抑制剂与纯化后的相应sgRNA，得到Cas12f/sgRNA复合体。

下一步，该复合体被直接用于剪切随机PAM文库，剪切完成后的双链DNA为粘性末端。接下来，为了测序，要先用T4 DNA聚合酶补齐为平末端，再用Taq酶对3′端进行了加A处理，去除RNA并纯化后，将加A产物与3′-dT的双链DNA接头进行连接，之后即可进行PCR扩增并测序得到这些剪切产物中的PAM。最后，研究者们就得到了各种不同Cas12f对PAM的偏好（图3）。结果表明，大多数Cas12f偏好富T的5′-PAM序列。

图3.不同Cas12f蛋白识别和剪切dsDNA的PAM序列偏好[1]

确定了这些Cas12f的PAM偏好后，研究者又进一步以纯化的Un1Cas12f1蛋白为对象，探索了其dsDNA剪切的最佳反应条件。结果表明，Un1Cas12f1是一种Mg2+依赖性的核酸内切酶，在低盐浓度（5-25 mM）下功能最佳，在∼37-50℃的宽温度范围内具有活性，最佳温度为∼46℃，sgRNA的最佳spacer长度为~20 nt。在此优化的反应条件下，Un1Cas12f1能够将超螺旋质粒DNA完全转化为线性形式（图4）。突变失活两处RuvC活性位点会消除这种剪切活性，证实了RuvC结构域对于这一剪切活性至关重要（图5）。

图4. 最佳反应条件下，Un1Cas12f1能够将超螺旋质粒完全转化为线性形式[1]

图5. Un1Cas12f1对dsDNA的剪切需要依赖RuvC结构域[1]

他们首先在大肠杆菌中转入了一个质粒，该质粒可以表达Cas12f蛋白以及T7转录相应的sgRNA。接着，在该能够产生Cas12f与sgRNA的大肠杆菌中，通过电转化引入携带靶标序列的低拷贝质粒。最后，将这些细胞10倍梯度稀释后生长于含有诱导剂与抗生素的平板上。

图6.能表达Un1Cas12f1与转录sgRNA的质粒[1]

实验结果令人意外，大部分的Cas12f并没能干扰低拷贝靶标质粒的进入，与对照组的生长情况没有肉眼可见的区别（仅AsCas12f1与SpCas12f1产生了显著的质粒干扰）。不过，这与先前的一项研究结果是一致的——Un1Cas12f1不能耗尽大肠杆菌中的PAM质粒文库，这也可能是它没有被检测到PAM依赖性的dsDNA剪切活性的原因之一。作者在文中也没有对这一现象做进一步的推测（图7）。

图7.大部分Cas12f不能在大肠杆菌中产生显著的质粒干扰[1]

参考文献：

[1].Karvelis T, Bigelyte G, Young JK, Hou Z, Zedaveinyte R, Budre K, Paulraj S, Djukanovic V, Gasior S, Silanskas A, Venclovas Č, Siksnys V. PAM recognition by miniature CRISPR-Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage. Nucleic Acids Res. 2020 May 21;48(9):5016-5023. doi: 10.1093/nar/gkaa208. PMID: 32246713; PMCID: PMC7229846.

[2].Harrington LB, Burstein D, Chen JS, Paez-Espino D, Ma E, Witte IP, Cofsky JC, Kyrpides NC, Banfield JF, Doudna JA. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 2018 Nov 16;362(6416):839-842. doi: 10.1126/science.aav4294. Epub 2018 Oct 18. PMID: 30337455; PMCID: PMC6659742.

[3].Makarova KS, Wolf YI, Iranzo J, Shmakov SA, Alkhnbashi OS, Brouns SJJ, Charpentier E, Cheng D, Haft DH, Horvath P, Moineau S, Mojica FJM, Scott D, Shah SA, Siksnys V, Terns MP, Venclovas Č, White MF, Yakunin AF, Yan W, Zhang F, Garrett RA, Backofen R, van der Oost J, Barrangou R, Koonin EV. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat Rev Microbiol. 2020 Feb;18(2):67-83. doi: 10.1038/s41579-019-0299-x. Epub 2019 Dec 19. PMID: 31857715; PMCID: PMC8905525.