技术帖：抗体的荧光、胶体金标记实验要点

荧光抗体标记技术是将荧光素以化学方法与特异性抗体共价结合，形成荧光素-蛋白质结合物（即荧光标记抗体），此结合物仍保留着抗体活性，同时具有荧光素的示踪作用。当它与相应的抗原特异结合后，借助于荧光显微镜观察呈现明亮的特异荧光。实验中常用异硫氰基荧光黄（fluorescein isothiocyanate, FITC）作为标记物，在碱性溶液中，FITC上的化学基团异硫氰基（-N=C=S）与抗体蛋白自由氨基（主要是赖氨酸的ε-氨基）结合，形成荧光抗体，以测定细胞相应抗原的存在。FITC具有很高的量子产量（发射光与吸收光的比值,0 .85），而且形成的偶联物的稳定性很好。FITC是应用最广的荧光染料，流式细胞仪就按FITC的特性，设计了激光波长为488 nm,很接近于FITC的最大激发波长492nm）。

作为标记的荧光素应符合以下要求：

应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。

荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。

荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。

与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。标记方法简单、安全无毒。

操作步骤：

用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/ml，或抗体对该缓冲液充分透析，以足以使赖氨酸不解离（去其正电荷），但注意保持大部分蛋白质仍未变性；

将透析袋放入100ml 含0 .1 mg/ml 的pH9.8碳酸氢钠缓冲液（新配制）的烧杯中，用铝铂包烧杯以避光，4℃搅拌过夜；

上述抗体液对PBS在4℃透析以终止反应。其间至少更换PBS液三次，直致480nm 的吸收为零；

加入0.5g/L 的叠氮钠。此后，结合物在4℃避光保存，或分装后在－20℃冻存。

荧光偶联质量的检测：

用标准免疫荧光染色试验以测定偶联率。

或用F/P值测定对其FITC标记质量进行鉴定。

取结合物液0.2ml，加PBS 2.8ml（或两者均改用半量），测定其A490/A280，查 FITC标志曲线得其浓度μg/ml值，按IgG的消光系数（mg/ml约A280 1.2）,可计算其F/P值，即每mg抗体所标记的FITC的比值，以此鉴定及比较各批标记物的质量。

实验要点及说明

偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此pH水平；

要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应，因此会降低蛋白质与FITC的偶联率）；

FITC与蛋白质的比值（F/P）,可通过测定495nm与280nm吸光度来鉴定。此比值的范围应为０.3－１.0（方法见前）；

FITC唯一的缺限是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存；

如果FITC－复合物对PBS透析不充分，可能造成高本底，对免疫荧光染色产生干扰；

如果被标记的蛋白质是第二抗体或通用的第一抗体，则从商品购置可能更方便可取。

2.免疫胶体金标记抗体及检测抗原

胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能利用到。

胶体金在光镜和电镜中均为有效的标记物，可以检测单一和多重抗原。胶体金在电解质中不稳定，但被蛋白质包被的胶体金是稳定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被胶体金，可作标记二抗进行免疫检测，本方法应用范围广，染色后的样品可以长期保存。

操作步骤

胶体金溶液制备

称取0.1g 氯金酸钠，溶解于1L去离子水中；

加热煮沸，剧烈搅拌下，迅速加入25ml新配的1％柠檬酸钠溶液；

继续煮沸5分钟，至溶液变成桔红色；

用蒸馏水将溶液的525 nm波长下的光密度吸收值调到 0.8。

胶体金的包被

将山羊抗鼠Ig抗体离心30分钟；

上清液经0.2 nm 滤膜过滤；

确定蛋白质包被的最佳浓度：将蛋白质作连续10倍稀释各1ml，加入5ml胶体金溶液，1分钟后加入1ml

10％氯化钠溶液，静止5分钟；以胶体金溶液为空白对照测定光吸收度，选择最低吸收值的蛋白质浓度用于正式包被。

取50ml胶体金溶液，用0.2M K2CO3调pH值为7.6，按照确定的最佳比例将蛋白质加入并快速混合，让蛋白质吸附2分钟后，加0.5ml 1%聚乙二醇，防止非特异性凝集；

离心1小时，弃上清液，将胶体金悬浮于含 1％ 聚乙二醇的 PBS中；重复一次；

弃去上清液，将包被的胶体金溶液用5 ml含1% BSA的PBS稀释, 经微孔滤膜过滤后，4℃保存。

抗原检测

取20ul人外周血白细胞与5l T淋巴细胞特异的单克隆抗体在4℃下孵育30分钟；

1000 r/min离心清洗细胞5分钟，2次；

将洗涤后的细胞与20l（一般效价1:20）胶体金标记的山羊抗鼠Ig抗体在室温下孵育30-60分钟；

1000 r/min离心清洗细胞5分钟，2次；

将细胞涂片于载玻片，用1% 戊二醛固定细胞10分钟，清洗多余固定液；

将载玻片细胞面向上置于放有湿润滤纸的培养皿中，加4滴50%硝酸银溶液和2滴明胶显色液，覆以盖玻片，放入60-65℃的温箱中，显色3-4分钟，直至玻片标本呈现金褐色为止；

移出盖玻片，用蒸馏水迅速漂洗数秒，晾干；

光学显微镜下观察。

实验要点及说明

所使用的器皿均应非常洁净，需经过硅烷化处理；

使用高纯度多次蒸馏去离子水；

胶体金颗粒的形成、大小和速度，均决定胶体溶液的稳定性，水质和玻璃表面对启动还原和稳定胶体十分重要，本过程制备的胶体金颗粒直径约为18-20 nm；

因为胶体金在电解质中不稳定，本实验全部操作过程要严格、迅速，注意液体颜色；

蛋白质包被胶体金时的相对最佳浓度要事先测定，测定最佳浓度时，胶体金溶液的pH值也要调节到pH7.6；

一抗和胶体金标记二抗的稀释浓度应事先经预试验以最佳效价。