来源：中华预防医学杂志, 2022,56(10) : 1520-1526. 作者：刘琳 许正文 孟兰兰 卢一凡 翟燕红 曹正（首都医科大学附属北京妇产医院 北京妇幼保健院检验科&临床质谱检验中心，北京 100026） DOI: 10.3760/cma.j.cn112150-20220329-00298 摘要 液相串联质谱技术具有高灵敏度、高特异性、高通量等特点，可以准确、高效的检测维生素、胆汁酸、类固醇激素、代谢小分子等人体内水平的变化。液相串联质谱技术作为预防医学中筛查、诊断疾病的一种有效手段，在妇幼健康方面广泛应用，有效降低妇幼疾病的发生率，提高我国妇幼人群的健康水平。目前质谱技术在我国面临着许多挑战，但同时也有诸多机遇。本文将阐述液相串联质谱技术在妇幼健康领域的代表性应用方向，并讨论临床实验室开展质谱检测遇到的主要一些问题。
一
液相串联质谱的基本工作原理 质谱是将待测物中的各组分离子化，依据离子质荷比（mass/charge，m/z）不同，从而对待测物的精准定性和定量分析［1］。然而在临床的应用过程中，血液、尿液等样品中还有大量的盐、蛋白质等高丰度的干扰物，会引起不同的离子干扰效应，导至质谱测定结果存在误差。LC-MS/MS是液相色谱和质谱联用的一种分析方法，液相色谱有效地将样品中目标物质与其他组分分离开，再经过质谱识别检测［2］。由于LC-MS/MS具有高灵敏度、高特异性、高通量、单次测定成本低、可同时检测多种物质的优势，所以，在许多小分子的定量检测中成为“金标准方法”或“参考方法”［3］，近年来在临床工作中获得了越来越多的应用。
二
液相串联质谱在妇幼健康领域的应用状况 （一）血清维生素检测 维生素是维持人体正常生命活动但无法自行合成或合成不足，必须从外界获取的一类微量有机物［4］。孕妇较正常女性会消耗更多的维生素物质，但从外界摄入食物所获得的维生素含量有限，很难满足孕妇和胎儿对其的需求，因此，妊娠女性更易缺乏维生素。由于孕妇体内维生素不足会对自身和胎儿的健康产生危害［5］，临床会采用监测维生素浓度变化的方式预防疾病发生。比如，监测维生素A预防夜盲症、监测维生素D预防佝偻病、监测叶酸预防新生儿神经管畸形。因此，精准检测孕期女性体内维生素含量显得尤为重要。维生素按照溶解的性质可分为脂溶性维生素和水溶性维生素。 1.脂溶性维生素：脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K，溶于脂肪而不溶于水。其缺乏会导至孕妇不良妊娠结局发生的风险增加，包括妊娠期糖尿病［6］、胚胎发育不良、复发性流产、子痫前期、早产、子代先天性心脏病、巨大儿等疾病。脂溶性维生素种类多且浓度差距大，不同种维生素之间也会存在协同或拮抗作用［7, 8］，对多种维生素同时检测有助于有效评估孕妇身体状态，预防相关疾病的发生。目前常见的人体脂溶性维生素状态评估是对25（OH）D3（25-hydroxy cholecalciferol，25-羟基维生素D3）、视黄醇（维生素A）和α-生育酚（维生素E）的同时测量［9］。临床实验室常用的检测方法有酶免疫法、高效液相色谱法、液相串联质谱法［10, 11］。酶免疫法易受到代谢物、抗体等物质的干扰，特异性和敏感性低；高效液相色谱法存在“柱外效应”，灵敏度差，且只能单组分检测。而LC-MS/MS能够对待测物组分纯化并电离生成不同质荷比，根据质荷比进行定量分析，实现多种维生素同时检测。比如，对人体25（OH）D3、视黄醇和α-生育酚的同时测量，有效评估人体脂溶性维生素状态。此外，LC-MS/MS也可对同一物质不同亚型精准检测。比如，对人体内维生素D2、维生素D3、25（OH）D2和25（OH）D3同时分析，准确评价孕妇维生素D营养状况［9，12］。因此，LC-MS/MS被认为是评估人体脂溶性维生素水平的“金标准方法”。与传统临床实验室检测方法相比，LC-MS/MS具有高特异性、高灵敏度、高通量、高效率的特点，能够准确评估妇幼人群脂溶性维生素的缺乏程度，为临床提供有效信息，及时有效预防疾病的发生。 2.水溶性维生素：水溶性维生素是溶于水而不溶于非极性有机物的维生素，包括B族维生素、维生素C等。它们参与人体基本代谢活动，维持机体正常生长发育。比如，维生素B3在人体新陈代谢、DNA修复及神经系统中发挥重要作用，维生素B5能够使糖类、脂肪等转变成能量，维生素B6是维持神经系统、免疫系统健康的必要物质。缺乏水溶性维生素会导至妊娠糖尿病、贫血、癫痫、脓毒症等相关疾病［13］，还有增加孕妇自身流产、早产等不良妊娠结局的风险。目前临床实验室中常用的分析方法有微生物法、光度法、高效液相色谱法、电化学法等［14, 15, 16, 17］。传统微生物法检测时间长、鉴定微生物种类有限、准确度一般，光度法易受到样品基质的干扰，电化学需要较多样本量。由于人体内源性血清水溶性维生素含量低，且B族维生素中各个小分子化合物理化性质并不相似，应用传统方法无法满足多种水溶性维生素同时检测的要求。LC-MS/MS具有高灵敏度、高特异性、高通量、单次测定成本低，检测时间短的优势，对多种水溶性维生素同时定性、定量分析［18］，为临床诊断提供可靠的评判依据。因此，对于孕妇常规维生素检测，LC-MS/MS仍是首选检测方法。LC-MS/MS的广泛应用，可以客观评估孕妇体内维生素水平，防止维生素缺乏或过度补充等原因导至的相关疾病。 （二）红细胞叶酸检测 已有研究表明孕妇缺乏叶酸是新生儿神经管畸形的主要原因［19］，但叶酸不能在人体内合成，并且女性在妊娠期间因为胎儿和孕妇细胞增殖活跃等多种原因需要更多的叶酸。北京大学生育研究所团队［20］对2000—2020年育龄妇女叶酸水平进行评估，发现大多数国家育龄妇女叶酸水平尚未达到理想状态。因此需要及时对孕妇进行叶酸检测，从而通过外部摄入补充更多的叶酸，来保护孕妇和胎儿的健康。红细胞叶酸水平代表机体组织叶酸的贮存情况，也代表了参与人体新陈代谢的叶酸水平。红细胞叶酸具有极高的稳定性，不受孕妇近期饮食与药物摄入的影响，与血清叶酸相比，是评估人体组织内叶酸营养状况更敏感的指标［21］。临床实验室对红细胞叶酸检测的方法有微生物分析法、化学发光分析法、蛋白结合法、LC-MS/MS等方法。微生物分析法相对容易测定总叶酸，但无法准确测量5-甲基四氢叶酸、甲基四氢叶酸、四氢叶酸等衍生物。微生物分析法还会受到抗菌药物和叶酸衍生物的影响，并且蛋白量和pH值也会影响蛋白的结合造成结果误差的发生。化学发光分析法对激素敏感，受试剂盒中的抗叶酸药物的影响。而LC-MS/MS具有高特异性、高灵敏度、检测时间短、高通量、单次测定成本低的特点，根据叶酸及叶酸衍生物的理化性质的不同，直接精准分析孕妇红细胞叶酸及其衍生物浓度和缺乏程度，有助于临床上及时诊断并有效预防疾病的发生［22］。 （三）胆汁酸谱检测 胆汁酸是胆汁的重要成分，参与人体脂肪代谢，促进肠道对脂类的消化吸收。妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是妊娠期妇女常见的疾病之一，与孕妇的胆汁酸代谢障碍有关。实验室检测表现为血清胆汁酸升高，临床表现主要为皮肤瘙痒。临床上常用孕妇血清总胆汁酸水平作为诊断、评估ICP的参考指标，对妊娠不良结局有预测意义［23］。现在临床上普遍认为孕妇体内胆汁酸含量过高会引起新生儿呼吸窘迫综合征、早产、胎儿猝死等并发症的发生。但ICP是可逆的，及时诊断和监测ICP，可有效减少母亲的不适症状和生化异常，降低母亲及新生儿发生各种并发症的风险。此外，无症状高胆汁酸血症（asymptomatic hypercholanemia of pregnancy，AHP）也是孕妇胆汁酸代谢障碍相关的疾病，无皮肤瘙痒，仅出现血清总胆汁酸升高［24］。但皮肤瘙痒是主观症状，易受多种因素的影响，仅通过血清总胆汁酸增高很难将其与ICP区分，易误诊为ICP。有研究［25］表明牛磺结合型胆酸可以作为ICP与AHP鉴别诊断的标志物，并且发现若能够联合两者之间的差异性胆汁酸（牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸）构成联合指标，更能有效的提高诊断准确率，为以后更好地鉴别诊断这两种疾病提供了有效的依据。目前传统的检测方法无法明确胆汁酸各亚型的含量变化。而LC-MS/MS仅通过少量的血清胆汁酸样品进行分离、定量检测，便可同时检测出胆汁酸各亚型水平变化，为有效鉴别疾病提供了依据。并且，有研究［26］证明检测人和大鼠胆汁淤积性血清中的胆汁酸浓度时，LC-MS/MS比酶促法更准确，具有高特异性、高灵敏性等优势。LC-MS/MS能够为临床提供更特异的信息，帮助医生对疾病正确分析评估，达到早期预防疾病，防止母儿不良后果发生的目的［27］，因此，深得检验医学领域的重视。 （四）类固醇激素检测 类固醇激素，是一类脂溶性激素，参与人体生命代谢、机体生长发育等正常生命活动。由于血液中类固醇激素具有浓度低、易受基质干扰、存在个体和周期性变化等特点［28］，临床检验部门需要高特异性、高敏感性的检测手段对类固醇激素检测。目前常用的检测手段包括放射免疫分析法、化学发光免疫分析法、液相串联质谱技术。但放射免疫分析法具有放射性核素污染环境、标记物不够稳定等缺点，化学发光免疫分析法具有特异性低、稳定性差、易受干扰等不足，两者都不能满足临床实验室的检测要求。有研究［29］表明在女性血清总睾酮定量检测中化学发光分析法灵敏度为 0.354，特异度为 0.983，约登指数为 0.337，LC-MS/MS灵敏度为 0.563，特异度为 0.943，约登指数为 0.506，提示LC-MS/MS的灵敏度及特异度较化学发光分析法高。而LC-MS/MS具有高敏感性、高特异性、高通量、分析谱广、分析时间短等优势，可对血液中类固醇激素精准检测，能广泛应用于临床。 1.雄性激素质谱检测在儿童性早熟评估中的应用：随着生活水平的提高，儿童性早熟的发病率也随之升高。临床上通过检测性激素六项（孕酮、垂体催乳素、雌二醇、睾酮、促卵泡生成素及促黄体生成素）评估儿童性早熟情况，判断原因和病情进展［30］。目前临床常用的检测方法是免疫法，但由于其易受到其他类固醇、脂质等结构类似物的干扰且敏感性差，不能对人体内浓度极低的性激素精准检测，故不能满足临床检验部门的检测标准。而LC-MS/MS具有高特异性、高灵敏度的优势，可实现对极低浓度的类固醇激素准确检测，且可同时检测多种内源性性激素［31］。此外，有研究［32］表明环境内分泌干扰物是导至儿童性早熟的主要原因之一。内分泌干扰物种类多，且血液中浓度低，LC-MS/MS可同时测定血液中双酚A、双酚B、正壬基酚、对壬基酚等多种内分泌干扰物的含量［32］，可对儿童性早熟具有更早的预判。因此，LC-MS/MS凭借其高特异性、高灵敏度，高通量的特点，已逐步取代传统方法成为儿童性早熟有效的检测手段，为临床诊断儿童性早熟提供初步的判断依据，有效预防儿童性早熟的发生。 2.雄性激素质谱检测在女性高雄激素血症中的应用：多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是我国育龄期妇女最常见的内分泌代谢性疾病，在生化方面主要表现为雄激素过高，因此，女性体内雄性激素水平是临床诊断 PCOS 的重要依据［33, 34］。人体内雄性激素存在不同亚型，主要包括睾酮、硫酸脱氢表雄酮、雄烯二酮、17-羟基孕酮、双氢睾酮。人体内睾酮含量最高，是临床上判断女性雄性激素过高的主要依据，其中游离睾酮具有生物活性，是诊断女性高雄激素血症更为敏感的指标［35, 36, 37］。此外，也有研究表明，除睾酮外的其他雄性激素水平在POCS患者与正常女性之间也会存在不同。因此，为了更能有效诊断POCS，需对游离睾酮和其他雄性激素检测。传统方法对其测定有局限性，且灵敏度和特异性不高。而LC-MS/MS所需样本量少，可对游离睾酮直接检测，还可同时检测睾酮、雄烯二酮等多种雄性激素，具有高敏感度和高特异性的特点，是雄性激素检测的首选方法，可有效帮助临床上评估、诊断POCS［38］。 （五）新生儿遗传代谢病生物标志物检测 新生儿遗传代谢病是由于基因突变导至新生儿身体缺乏某种酶、受体、载体等有机物质，从而引起氨基酸、有机酸和脂肪酸代谢障碍的疾病［39］。新生儿遗传代谢病累及全身组织、器官，严重威胁新生儿的生命健康，且总体发病率高，临床表现复杂，症状、体征缺乏特异性，难以诊断。新生儿遗传代谢病筛查项目在婴儿出现症状前即可检测出可治疗的疾病，可显著降低新生儿遗传代谢病的发病率和死亡率。目前常用的检测手段有LC-MS/MS、免疫学、酶学等生化检测和高通量测序技术（next generation sequencing，NGS）［40］。NGS在出生缺陷的一、二、三级预防均可应用，具有可筛查上千种疾病、并能在分子层面明确病因、不受外界因素干扰的优势，也存在难以预测基因变异可能出现的临床表型和疾病严重程度、高昂的成本、种族基因数据库规模不足的缺点。因此，NGS现阶段尚不能作为新生儿遗传代谢病的一线筛查方法，但可将NGS作为补充诊断方法，有效降低假阳性率［41］。有研究［42］应用高通量测序技术与生化检测中的时间免疫荧光法和串联质谱法对211例新生儿进行新生儿遗传代谢病筛查，并对二者筛查结果进行对比分析，结果显示生化筛查的灵敏度 100%、特异度 100%，高通量测序技术的灵敏度 80%、特异度 100%，提示传统生化筛查灵敏度及特异度较高通量测序技术高。传统的免疫分析法易与血液中结构相似的化合物发生交叉反应，存在较高的假阳性率。LC-MS/MS是生化检测中的一种新兴检测手段，可以做到氨基酸、游离肉碱、酰基肉碱等代谢小分子物质同时精准检测，一次分析快速检测30多种遗传代谢病。由原先仅筛查苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减低症两种疾病到现在一次可筛查数十种疾病，LC-MS/MS有效扩大了疾病筛查谱，有助于临床早发现、早治疗新生儿遗传代谢病，降低婴幼儿的死亡率。并且在初始筛查步骤之后，也可用于筛查阳性样本，作为区分真阳性和假阳性的二级测试，显著提高了待测物检测的准确性。LC-MS/MS极大提高了检测的效率和质量，减少了检测成本，明显提升了新生儿遗传代谢病的检出率和早期干预程度。
三
液相串联质谱临床应用面临的挑战 液相串联质谱技术具有高灵敏度、高特异性、高通量等优势，提高了疾病诊断的准确性，能够有效预防疾病的发生，在临床上精准指导临床用药，提高临床工作效率，降低疾病的发生率和死亡率，因此，逐渐受到临床实验室的重视，具备广阔的应用前景。然而，我国质谱科研成果和高端人才储备不足、创建质谱检测平台成本高、各实验室的结果不一定具有可比性等多种原因。LC-MS/MS也存在自动化程度低，标本不能即来即测，易受到样本其他物质的干扰等不足；使得LC-MS/MS技术在专业、设备、管理等方面仍存在诸多的不足和挑战，一定程度上制约了其临床推广应用。 1.质谱检测方法开发和检测专业人才培养不足：LC-MS/MS在操作流程方面，自动化程度低，易受到试剂纯度或耗材杂质的干扰，且有进行样本前处理、人工进样等复杂的操作步骤；在检测结果方面，原始的质谱检测数据对于医生来说并不具备临床意义，需要将复杂的质谱数据以易于理解且具有临床意义的形式传达给临床医生［43］。无论是技术操作还是数据分析，都对工作人员的知识储备和操作规范要求非常高，这样才能保证结果的准确性、有效性，保证对医生诊断和治疗疾病有用，为妇幼人群的健康保驾护航。但LC-MS/MS在临床实验室的应用仍处于起步阶段，具备分析化学、卫生检验、临床医学等相关知识的复合型人才缺乏，限制了LC-MS/MS在临床医学检验部门的大量应用［44］。 2.实验室自建项目（laboratory-developed test，LDT）管理制度不完善：由于LC-MS/MS极高的特异性以及样品前处理策略的多样性，对于相同目标待测物检测开发的不同LC-MS/MS方法之间会存在较多的变量［45］。由于潜在的临床需求，体外诊断市场上出现一些基于标本前处理步骤的商品化质谱试剂盒。但此类试剂盒多为体外诊断一类备案试剂，仍需要实验室进行基本的方法优化和严格的性能验证，才能向临床提供检测服务。因此，目前绝大部分基于LC-MS/MS平台的检测项目，仍然属于实验室自建项目，即LDT。但我国医学检验部门开展的LDT制度尚不完善，对其定义和范围也无清晰的认识，与欧美发达国家还有很大的差距［46］。因此，需要建立适合我国国情的LDT制度，将LC-MS/MS实现从实验室到临床应用的快速转化，应用于妇幼人群。 3.质谱成本高：质谱仪的高特异性、高通量、高灵敏度等优势与其关键部件的加工精度密切相关。质谱仪生产步骤复杂、生产周期长、加工精度高、研发成本高、售后服务涉及范围广等多种因素，导至我国的质谱仪研发、生产能力落后于国际水平，从而出现了我国质谱市场被国外企业垄断的局面，购买质谱设备成本难以控制［47］。再者，由于LC-MS/MS存在自动化程度低，还未标准化等不足，需要在开展临床检验前，建立相应的检测方法并对其进行验证，保证结果的准确性，也是质谱成本高的原因之一。高昂的设备、时间、人才等成本限制了质谱技术在我国各地区各医院的普及应用，也进一步限制了质谱技术在我国临床医学检验部门的发展。但LC-MS/MS是目前唯一能够直接检测样本相对分子质量的有效手段。从长远来看，LC-MS/MS具有高通量、高效率、高特异性、高敏感性、单次测定低成本等特点，可以带来低成本效益。因此，应大力发展国产质谱仪，引进、培养质谱相关人才，降低设备成本，实现低成本效益。
四
结语 液相串联质谱技术由于在检测小分子物质如维生素、类固醇激素、血清代谢物等方面结果精准、可靠，已经逐步在妇幼健康方面得到广泛应用。并有研究表明［48］，建立了一种灵敏的LC-MS/MS方法，可同时定量人血浆和唾液中的MPV及其代谢物β-d-N4-羟基胞苷，为新冠肺炎患者在临床上的诊断和治疗提供依据。但发展中还面临诸多技术和管理方面的挑战，要加快LC-MS/MS在医学检验部门的应用，需要做好以下方面的工作：（1）积极开展分析化学、质谱技术、卫生检验、临床医学等相关知识的课程培训并进行考核，保证操作人员具备与工作相关的理论知识和操作能力［49］；（2）选择试点单位，局部放开，同时在科学监管中进行创新和发展，总结经验，寻找适合我国国情的LDT制度，为 LDT在医学检验部门科学合理运用创造条件［46］；（3）积极进行质谱宣传，开展质谱相关知识培训，联合大学、医院检验部门、设备制造商等多部门，依据质谱技术原理开展、生产符合我国国情的质谱设备，普及LC-MS/MS在我国临床医学检验部门的应用，降低LC-MS/MS应用成本。期待在不久的将来，LC-MS/MS能更好、更广泛地为妇幼健康服务，有效减少妇幼疾病的发生率和过早死亡率，提高我国妇幼人群的健康水平。 利益冲突 所有作者声明无利益冲突 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
