一、背景及技术原理
流式荧光技术，是基于编码微球和流式技术的一种临床应用型的高通量发光检测技术，又被称为液态芯片、悬浮阵列及Luminex® xMAP技术等。该项技术是继生物芯片技术、化学发光技术之后的新一代高通量分子诊断技术平台，是临床诊断领域及生命科学研究中的一大热点。其综合了有色微球、应用流体学、激光技术及高速数字信号处理技术的技术优势，目前已被广泛应用于免疫分析、核酸检测、酶学分析、受体和配体识别分析等研究领域[1]。流式荧光技术是首个通过FDA认证的临床应用型高通量诊断技术,并被全球科技产业和行业的权威机构Frost&Sullivan授予“2005年度诊断技术革新大奖”殊荣。相关的研究论文在《自然》、《临床化学》等权威学术杂志上频频发表。
以目前主要的仪器机型 Luminex 200TM为例，平台中包含一种直径5.6 μm的聚苯乙烯微球，其被两种光谱特性不同的荧光染料染色。通过精确控制两种荧光染料的浓度配比（10×10），可以获得一个100种荧光编码的微球阵列，每种微球表面可结合一种反应物。微球表面拥有108个活化羧基基团，可以与蛋白抗体的氨基或核酸探针的氨基共价交联。由于微球可通过其编码荧光被识别，因而可以实现在一个混合反应体系中同时进行100项反应的检测。另一种荧光物质与报告分子交联，用于测定微球表面生物反应的量。在高速通过的流体束中，微球逐颗被两束激光进行分析。一束635nm的红色激光激发微球自身的荧光物质，而另一束532 nm的绿色激光激发结合在微球表面的报告荧光物质（藻红蛋白、Alexa 532或Cy3）。高速的激光信号处理读取微球编码对其分类，同时对其表面的反应进行定量。每种检测物的检测读取100颗微球的信号值，取中位值。在xMAP技术的基础上，Luminex公司于2007年推出的新一代液相芯片检测平台Flexmap 3D进一步提高了检测精度和线性范围。Flexmap 3D技术通过加入3种不同的荧光素,根据荧光素的比例不同可同时对一个样本中的500种不同目的分子进行检测,并且可以一次检测384个不同样本。
简要来说，在进行多重指标的联合检测时，首先将针对不同检测物的核酸探针/抗体或抗原以共价交联方式结合到特定荧光编码的微球上，通过免疫反应或核酸杂交，使待定荧光编码微球与被测物（可以是血清中的抗原/抗体或酶等，也可以是PCR产物）及荧光示踪物特异性结合，检测时微球排成单列通过检测管道，进行荧光信号的读取报告。
二、技术特色及优势
相比于传统的固态芯片杂交、ELISA及化学发光法等，流式荧光法具有诸多突出优势：
1、流式荧光技术具有通量高、速度快、操作简便等特点，一次检测可高达100个指标，同时可实现样本的批量处理。高速的激光信号处理，30s即可出一个样本报告，可高达10000测试/小时。平台的整个反应过程只涉及加样和孵育，反应所需的时间短，杂交后常不用清洗，即可直接读数，尤其适用于多指标的联合检测。
2、流式荧光技术的检测结果更可靠。其检测下限低至0.01pg/ml，而传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)仅为μg级，灵敏度提高了10—100倍。相比于ELISA法，流式荧光法的线性范围也更宽，可达3-5个数量级。此外，流式荧光技术具有很好的重复性，采用类均相的反应模式，其结果稳定，重复性非常好。检测时，抽取其中的100颗微球读数，数据取其中位值，减小误差。
3、流式荧光技术所用的标本量更少，一次检测仅需10-20μl，远小于传统化学或电化学发光法，更适合珍贵样本。此外，试剂耗材等的用量也更少。
4、流式荧光技术具有更广的适用性。在Luminex 200TM上即可以检测蛋白又可以检测核酸，既可用于临床又可以服务于科研，不断推出的新产品使其具有很好的平台延展性。
三、应用领域
流式荧光技术一经推出即在医学检验及生命科学领域受到了了广泛关注和积极的推动。其在HLA配型、SNP分型、微生物的检测、基因突变检测、肿瘤标志物检测、HPV分型等众多免疫、分子检测领域具有广泛应用。
1、肿瘤标志物
Sun等[2]基于Luminex 100平台，建立了5个肿瘤标志物的联检方法，与传统的ELISA法相比，不仅省时省力，且有更宽的线性范围。谢冲等[3]建立了Luminex液相芯片同时检测tPSA、fPSA的方法，与ELISA测定结果高度相关，且显示了灵敏度高、重复性好、系统误差小等优点。在流式荧光平台上，Doseeva等[4]对NCLC确诊患者及有同等吸烟史的阴性对照的肿瘤抗原（CEACA125CYFRA21-1）和自身抗体(NY-ESO-1)进行了测定，并构建了肺癌预测模型。Cañadas等[5]采集了43名非小球细胞肺癌（SCLC）患者的诊断及预后的血样，并同时利用Luminex技术对血清中血管生成素相关细胞因子（血管生成素-2、VEGF-A和D）进行测定，结果发现显著高出常人的量，为血管生成素-2导至SCLC不理想的临床表现提供了新的证据。Chen等[6]基于该技术发现循环肿瘤细胞结合血清中CEA水平监控可有效提高NCLC的临床预测率。Song等[7]利用流式荧光技术研究比较了卵巢癌筛查时用血清和尿液样本中生物标志物的表现差异。Nassi等[8]利用流式荧光技术，发现肿瘤标志物HE4、CA125的联合检测可有效辅助评估上皮性卵巢癌复发的风险。
2、细胞因子与自身免疫疾病
Luminex xMAP技术常被用于细胞因子的测定。如Dernfalk等[9]成功将Luminex xMAP技术用于IL-1、IL-6及α-TNF。Miķelsone等[10]在研究吸烟对心血管炎症状态的影响时，单核细胞趋化蛋白1、α-肿瘤坏死因子及白介素6的测定也使用了xMAP技术。钱源等[11]在此技术平台上进行了与胰岛素抵抗相关的脂肪细胞因子水平在妊娠期糖耐量受损孕妇中的相关性研究,发现血清瘦素水平与妊娠期糖耐量受损(GIGT)密切相关,如果改善血清瘦素水平,提高胰岛素敏感性,将对 GIGT的防治有重要的临床意义。而IL-6、TNF-α、MCP-1等细胞因子水平与GIGT则无关。Preuner等[12]使用Luminex xMAP技术，对大范围的临床相关致病真菌进行了特异性种属鉴定。Szliszka等[13]在研究阿替匹林C对活化的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用时，即使用该技术测定培养上清中巨噬细胞释放的各种细胞因子的量。Rusnak等[14]在确定玻璃体视网膜的病变程度时，也用到了液相芯片法测定前房细胞因子的浓度。Lang等[15]基于Luminex xMAP技术测定了P13K抑制剂对一组人神经母细胞瘤的抑制效用，构建出P13K磷酸蛋白轮廓，对于特异性P13K靶向治疗具有指导意义。
马小美等[16]将流式荧光技术引入系统性红斑狼疮外周血IFN-γ、IL-6及IL-7的检测研究中，发现患者外周血中上述细胞因子表达失衡，即CD4+T辅助细胞亚群失衡，参与了疾病的发生过程和发展。Cho等[17]利用Luminex 200平台，对包括IL-6在内的细胞因子进行测定，发现低水平的血清IL-6可作为乙肝病毒相关性肝癌在治愈性治疗后复发的预测标志物。
Wang等[18]通过使用Luminex 200对转移性胃腺癌患者及未患病对照血清中的炎症因子进行测定，发现有几种炎症因子与转移性胃腺癌病变程度密切相关。
3、核酸表达及突变的检测
Yang等[19]建立了一种微球阵列用于基因表达检测的方法（BADGE），生物素标记的cRNA与结合在微球上的互补捕获探针杂交，用于对拟南芥特定基因的表达进行定量。测试结果与GeneChip Probe等同，且灵敏度低至10-30 copy/细胞，可用于中等基因表达量的检测。Wang等[20]利用Luminex xMAP液态芯片技术，测定了非小球细胞肺癌组织中miRNA的表达量，由于该技术呈现诸多优点，如所需样本量少、无需扩增、检测速度快等，作者认为该技术是用于miRNA高通量检测十分优良可行的方法。此前，Lu等[21]也曾将该平台应用到了多种肿瘤相关的miRNA表达谱的构建上。结果显示流式荧光法的特异性要明显优于固态芯片法，且与反向斑点杂交法的检测结果完全一致。流式荧光法除了准确性高、高效率低、成本外，具有更好的灵活性，可用于发现新的miRNA。Xun等
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