干货丨侧流层析技术背景、原理、设计以及国内外应用现状、发展前景

近年来，快速检测需求的增加刺激了新技术在临床诊断、环境监测和食品安全分析等领域的发展。目前已有很多技术可用于检测小分子和生物大分子，包括气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱技术、酶联免疫吸附检测（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）技术和生物传感器技术等。这些技术大都特异性强、灵敏度高，但耗时长且需要昂贵的仪器以及专业的操作人员。和传统方法相比，侧流层析技术（lateral flowchromatographic assay，LFCA）有很多优势，如成本低、易操作、快速、可实现现场检测及结果肉眼可见等。基于上述优势，自LFCA出现以来，其在基础及应用研究领域取得了快速的发展。

1980年首次研制出检测人绒毛膜促性腺激素的LFCA试纸被用以诊断早孕。自此以后，LFCA被广泛的运用于检测各种分子，包括肿瘤标志物、微生物、霉菌毒素、重金属和农药等。本文主要从LFCA的原理、技术结构、研究动态等方面予以阐述。

LFCA主要是基于免疫识别或者核酸杂交以及抗体标记技术，使待检测物中各组分（抗原、抗体、蛋白质、核酸等）通过毛细管作用力的移动速度差异，在反应基质上实现分离的色谱系统。

LFCA由4 个部分组成，即样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，将这4 个部分叠加于支撑底板上就构成了一个简易的LFCA试纸条（图1）。样品垫为经过处理的纤维膜或玻璃棉，用于快速吸收待检样品，使其利用毛细管作用向结合垫方向侧向流动。结合垫为纤维膜或玻璃棉，吸附有标记的生物活性材料（如金标抗体），它可与待检样品溶液里的检测靶标结合形成肉眼可见的免疫复合物。层析膜大都为硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜，它是LFCA的关键材料，为分析物之间的反应提供了平台，其上固定有两条或多条不同生物活性物质（如抗原或抗体）喷印的“检测（test，T）线”和“质控（control，C）线”，用于拦截带标记的免疫复合物，并可直观地显示检测结果。吸水垫为吸水纸板，用于吸收流过层析膜的待检样品，以平衡层析膜两边的压差，促使更多待检样品在层析膜上侧向流动。

LFCA是一项基于抗原抗体特异性结合或核酸探针和靶向核酸杂交反应来检测样品中目标物质的有效技术。其中，当抗体被用作生物识别因素时，LFCA又叫免疫层析试纸快速检测技术。它是一种20世纪80年代发展起来的将标记免疫技术和色谱层析技术结合起来的固相膜免疫分析方法，依据其免疫层析反应时抗原与抗体结合方式的不同，主要分为两类，即双抗体夹心免疫层析法和竞争免疫层析法。

由于含有较多的抗原位点，双抗体夹心法适用于检测大分子物质。该模式中使用了3 种抗体：第一种是被标记材料标记在结合垫上的将与样品中抗原特异性结合的单克隆抗体1（monoclonal antibody 1，mAb1）；第二种是喷印在T线上的与不同抗原决定簇结合的捕获单克隆抗体2（monoclonal antibody 2，mAb2）或多克隆抗体（polyclonal antibody，pAb）；第三种是被喷印在C线上的抗种属特异性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的“抗抗体”。

以胶体金标记法为例，其检测原理如下：利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与结合垫上的金标抗体和T线上的捕获抗体结合，形成“金标抗体（mAb1）-待测抗原-捕获抗体（mAb2或pAb）”复合物；该复合物因为有胶体金的缘故而显红色，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，C线将未被T线拦截的金标抗体mAb1及部分抗原-金标抗体复合物拦截并反应显色。于是，当滴加到样品垫上的待测样品通过毛细管作用向前层析到结合垫上时，会溶解其上的金标抗体并一同向前涌动：如果样品中含有抗原，T线和C线均会显现红色；反之，T线无条带，C线显红色（图2）；C线不显色则结果不能判断。

小分子不能同时结合两种及两种以上的抗体，而竞争法检测模式为竞争抑制性的免疫学结合反应，所以竞争法适用于抗原位点较少或仅有单个抗原位点的小分子化合物的检测。该方法中使用了两种抗体，一种是与样品中抗原特异性结合的抗体，另一种是喷印在C线上的二抗。与双抗体夹心法不同的是，竞争免疫层析法试纸条结果表现为：若样品中无靶标抗原，则T线和C线处均显现条带；反之，若样品中有靶标抗原，则C线处显现条带，T线处无条带，T线条带颜色深度与靶标抗原含量成反比；C线不显条带则结果不能判断。

竞争法分两种模式，一种用于检测抗原，另一种是当抗原材料中的干扰物质不易除去或不易得到足够的纯化抗原时，用来检测特异性抗体。以胶体金标记为例，在第一种检测抗原的模式中，用胶体金标记一定量的靶标抗原并固定在结合垫上，T线与C线分别喷涂与靶标抗原特异性结合的抗体（一抗）以及抗种属特异性IgG的“抗抗体”：对于阴性样品，金标抗原随样品侧向流动，在T线处与一抗结合，在C线处与二抗结合，结果T线和C线均显现红色；对于阳性样品，样品中未被标记的靶标抗原和结合垫上金标的靶标抗原通过竞争与T线处的一抗结合，样品中的靶标抗原越多，结合在T线上的金标抗原越少，显色也就越浅，而过量的金标抗原与C线处的二抗结合，故只有C线显现红色（图3）。

在第二种检测抗体的模式中，将抗体用胶体金标记在结合垫上，T线和C线分别包含抗原与载体分子（通常为牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA））的结合物以及抗种属特异性IgG的“抗抗体”。样品中的靶标抗体和结合垫上的金标抗体共同竞争T线上的抗原与载体分子的结合物：对于阴性样品，结合垫上的金标抗体分别与T线和C线上的固定物反应结合，使T线和C线均显现红色；对于阳性样品，样品中的靶标抗体会优先和T线上的抗原与载体分子的结合物特异性结合，样品中的靶标抗体越多，结合在T线上的金标抗体就越少，显色也越浅，而过量的金标抗体与C线处的二抗结合，故只有在C线处显现红色（图4）。

由于亲和素和生物素间特异性强、亲和力大、可分别结合各种大小分子而构成亲和素-生物素系统（avidinbiotin system，ABS），将核酸和LFCA结合起来。类似ABS，生物素-生物素抗体、生物素-链霉亲和素、荧光素-荧光素抗体、地高辛-地高辛抗体等系统也具有这种桥梁连接作用。

基于此，互补的核苷酸序列（DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA等）通过Watson-Crick碱基配对形成非共价键，从而形成稳定的同源或异源双链分子的核酸杂交过程，核酸也可被用作LFCA的生物识别元件。检测结果及分析如下：T线和C线均显条带者为阳性样品；C线显色而T线不显色者为阴性样品；C线不显色则结果不能判断。依据方法过程中是否需要抗体，基于核酸的LFCA中分为两种类型，一种是抗体依赖型（又称“核酸侧流免疫（nucleic acid lateral flow immunoassay，NALFIA）”），另一种是抗体非依赖型（又称“核酸侧流检测试纸条（nucleic acid lateral test strips，NALTS）”）。

抗体依赖型LFCA中运用了核酸-抗体相互作用以及双链DNA的特异性标记，因此又被称为NALFIA。NALFIA其实是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术与ELISA技术的结合应用。以胶体金NALFIA为例：首先针对检测靶标特异性基因片段设计一对相应的PCR引物，并对其进行两种不同标记物标记（如用生物素标记一条引物，而用荧光素标记另一条引物），通过PCR扩增产生双标记的双链扩增产物；制作试纸条，在结合垫上固定一定量能与扩增子标记物之一特异性结合的物质（如链霉亲和素或亲和素）和胶体金的复合物，T线喷涂特异性抗扩增子另一标记物的抗体的标记物（如荧光素抗体），C线喷涂能与结合垫上复合物特异性结合的物质（如生物素）；用制作的胶体金试纸条对PCR产生的扩增产物进行检测。

对于阳性样品，双标扩增子由于毛细管作用力从样品垫侧流至结合垫，其上的生物素与结合垫上的链霉亲和素或亲和素特异性结合，复合物又侧流至T线后，双标扩增子上的荧光素与T线上的荧光素抗体特异性结合，结合垫上过量的链霉亲和素或亲和素又与C线上的生物素特异性结合，又因结合垫上链霉亲和素或亲和素被胶体金标记，所以T线与C线同时显红色；对于阴性样品，结合垫上的链霉亲和素或亲和素与C线上的生物素特异性结合，所以只有C线显红色；C线不显色则结果不能判断。

抗体非依赖型LFCA因不依赖抗体而被称作NALTS。与NALFIA不同的是，NALTS的被检样品是单链核苷酸而非双链核苷酸，它的关键步骤是核酸杂交。核酸适配体是一小段经体外筛选得到的人造短链单链寡核苷酸（RNA或DNA），它们能特异性识别并结合靶向核酸且易于合成，并且在标记过程中不会失去活性，因此，核酸适配体常被用在NALTS中代替抗体发挥作用。以胶体金NALTS为例，结合垫上固定一定量被胶体金标记的捕获探针与标记物（如生物素）的结合物，T线喷涂结合探针或其与BSA的结合物，C线喷涂与结合垫标记物特异性结合的标记物（如链霉亲和素）。

对于阳性样品，单链扩增子与结合垫上的捕获核酸探针杂交，复合物又与T线上的结合探针杂交，C线上的链霉亲和素与结合垫上过量的生物素特异性结合，又因结合垫上捕获探针与生物素被胶体金标记，所以T线和C线同时显红色条带；对于阴性样品，C线上的链霉亲和素与结合垫上的亲和素特异性结合，所以只有C线显红色条带；C线不显色则结果不能判断。

NALFIA和NALTS因检测原理不同，检测灵敏度和时间也有所不同。因为杂交过程比标记物之间的亲和反应更耗费时间，所以NALTS需要的检测时间比NALFIA长；而灵敏度则与更多条件有关，无法给出统一结论。例如，赭曲霉毒素A是曲霉和青霉家族的次级代谢产物，它是一种小分子，适用于竞争性LFCA。基于适配子和抗体的LFCA可用于赭曲霉毒素A的检测。基于NALTS的检测限可达0.18 ng/mL，基于NALFIA的检测限为0.5 ng/mL。