常用基因测序方法种类及优缺点

基因测序方法有哪些？当今的主要技术基因测序技术相对成熟，DNA测序的主要方法有Sanger测序、下一代测序 (NGS) 和长读长测序。以下是对这些方法、优缺点和重要标准的简要回顾，可帮助您权衡下一个测序选择。

选择测序方法的标准很多，取决于研究人员及其项目的性质。正在研究的生物学问题是关键。Pacific Biosciences 副总裁Jonas Korlach 说：“研究的背景决定了使用哪种类型的测序，因为不同的测序方法具有不同的特征来推动选择。”

常见的标准包括测序时间、通量、成本和准确度——所有这些往往会相互影响。“准确性、成本和数据吞吐量之间的动态一直是测序技术选择的驱动因素，在不牺牲准确度的情况下，成本和通量的提高推动了DNA测序对广泛的应用。”

测序实验室成本主要包括购买仪器费用、实验室试剂耗材费用、样本数量、计划外包测序及测序前的准备步骤。还有另一个值得考虑的因素是要测序的目标的大小，这会也影响测序时间和成本。

测序过程中产生的读取长度也可能会影响决策，因为其中一些些应用需要较长的读取长度。比如：NGS产生MIN读长（约 50-500 bp），其次是Sanger测序（约 500-1000 bp），然后是长读长测序（约 5-30 kb）。

Sanger测序是一项久经考验的技术，对于少量样本来说简单快速，能够解析单个碱基对。它在掺入放射性标记的核苷酸类似物后通过链终止起作用。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的 DNA片段以进行鉴定。Sanger方法对包含重复和二级结构的复杂DNA区域很有帮助，并且通常被用作验证NGS检测到的遗传变异的正交方法。

但是，与NGS相比，Sanger测序的通量较低，因此可能不适合大型项目。Sanger测序可以对较小的DNA区域、一小组基因以及通常少于1000个样本进行高准确的测序。

事实上，对于较小范围的项目，使用Sanger基因测序方法进行靶向或聚焦测序的项目时间、成本和复杂性要低得多，通常使用的是细管电泳法，即：在毛细管电泳仪器上的毛细管内使用 Sanger测序化学，有助于查明基因片段中的单个碱基。

测序目标的会严重影响到测序方法的选择。Sanger测序适合少量基因或短基因组片段。NGS 测序发则适合用于 大面积的基因组或全基因组测序。 与使用Sanger测序相比，NGS测序法具有高通量的特点可以使大型项目快速、容易、低成本地进行完成测序。所以NGS是全基因组测序、全外显子组测序、分析大型基因组、检测稀有变异以及发现和诊断的较为理想的选择。然而，对于靶向测序，NGS可能比Sanger贵。同时，NGS所使用的NGS测序仪，仪器成本较高，而且NGS工作流程比Sanger测序更复杂，

在长读长测序中，DNA片段在穿过纳米孔时单独测序（Oxford Nanopore Technologies），或者在单个小孔中复制。较长的重叠序列使组装更容易，就像用更少的大块拼图拼图，而不是 NGS中更多的小块。其优点包括消除了扩增偏差，并且可以更容易地检测到大插入/缺失、重复区域等特征。长读长测序的错误率可能高于NGS，但持续的技术改进正在缩小准确度的差距。