| 快速且更有成本效益的全基因组测序（WGS）和分析可以为罕见及未确诊疾病的危重患者提供明确诊断，尤其是新生儿重症监护（NICU）的场景中。因为在这样的场景中，每一秒都很算数。所以，NICU的快速甚至超快速WGS成为精准基因组医学应用的一个关键阵地。NICU WGS的全球领军人物非Rady儿童医院的Stephen Kingsmore莫属。他带领的团队通过采用Illumina NovaSeq测序（SP流通池）加上快速的生物信息学分析流程在真实临床案例上实现了13.5个小时的WGS诊断记录。
这项纪录是由斯坦福大学医学院、NVIDIA、谷歌、UCSC 和牛津纳米孔技术 (ONT) 的联合团队实现的，团队于近期发表的Nature Biotechnology杂志文章中详细介绍了这一方法学。在此之前他们曾在新英格兰医学杂志上发表过文章提示了该分析管线用于诊断重症患者时的临床实用性。
ONT开发的PromethION48测序平台具有 48 个独立的流通池，能够在 2 小时内将单个样本测序到临床质量深度。此外，可以假定序列比对、变异识别（variant calling）和变异过滤可以实时启动并在数小时内完成，有可能实现WGS的加速。然而，要实现这一愿景充满挑战。首先，传统的样本制备方案没有考虑到从有限的临床血液样本中生成足够开展快速测序的文库，尤其是危重新生儿。其次，虽然完整的序列读取可以在开始运行后的几分钟内实时从纳米孔测序设备流出，由于 48 个流动池并行运行，数据生成速度远远超过本地 PromethION 计算塔（测序单元随附的数据采集单元）上可能的碱基识别（base calling）和比对的最高速度；这会导至高计算延迟，碱基识别和比对运行耗时比测序耗时要高一个数量级。第三，尽管小片段变异（SNV/InDel）的纳米孔识别管线已经在细胞系数据中被证明具有金标准的高精度，但它们的性能尚未在临床样本中得到表征。最后，传统的变异过滤和优先排序方法会导至大量（约 100 个）候选变异，这对于临床环境中所需的手动校阅（manual curation）和确认来说可能是费时费力的。因此Euan Ashley团队开发的超快速纳米孔 WGS 方法结合了优化的样品制备操作（是用来Qiagen改良的Puregene基因组DNA提取）、改进了文库制备（ONT的定制文库制备）、在 48 个流动池上平均分配测序（采用优化的方法使孔占有率达到 82%，在短短2个小时内快速生成 202 GB）、在 Google Cloud 计算环境中执行接近实时碱基检出和比对、加速变异检出和快速变异过滤，实现了高效的人工审查。总体上来说，这种创纪录的端到端基因组工作流程依赖于创新的纳米孔测序技术（一个孔喂入一段长的DNA分子并以电信号的形式实时传输序列信号，本质上比Illumina的合成测序加成像更快）和高性能计算，也利用长读长测序更好地分析结构变异。
超快纳米孔全基因组诊断工作流程 
a , 在 PromethION48 设备上开始测序后，原始信号文件会定时上传到云存储。我们基于云的管线跨 16 个实例，每个实例具有 4 个Tesla V100 GPU，共 64 个 GPU，扩展了计算密集型的碱基识别和比对，并与测序同步运行。这些实例旨在最大限度地利用资源，其中使用 Guppy 在 GPU 上运行碱基识别，使用 Minimap2在 42 个虚拟 CPU 上并行运行序列比对。b , 一旦比对文件准备就绪，使用 GPU 加速的 PEPPER–Margin–DeepVariant 在 14 个4 x P100 GPU实例上执行短片段变异识别（共 56 个 GPU），并使用 Sniffles 在 2 个实例上执行 SV 识别。每个实例处理一组特定的重叠群contigs。c，这些识别到的变异被注释以帮助随后的变异过滤和优先级排序。采用基于评分的变异过滤方法接收变异识别器报告的数百万个变异，以显示任何有害变异，以便使用 Alissa Interpret (Agilent Technologies Inc.)进行审查。过滤方法这样设计使其能够报告用于手动校阅的可处理数目的变异。来源于Nature Biotechnology文章。在NVIDIA年度大会GTC上，Euan Ashley教授也详细介绍了这个工作，感兴趣的可以注册听讲，关注本号，回复“极速“可获取Euan Ashley教授的讲演ppt。
超快纳米孔全基因组诊断的操作步骤，以上来源于Euan Ashley教授GTC演讲截图。关注本号，回复“极速“可获取Euan Ashley教授的讲演ppt。在GTC大会上，NVIDIA也透露自 NEJM 文章今年1 月份发表以来，NVIDIA Clara 团队一直在为 DGX-A100 优化相同的全基因组分析流程，使临床医生和研究人员能够在仅 8 个 A100 GPU 上部署与世界纪录方法相同的分析，并且60x WGS只需要 4 小时 10 分钟（下图以 HG002 参考样本为基准）。这不仅简化了单个服务器上的复杂工作流程，而且还将每个样本的成本从 568 美元降至 183 美元（降低了三分之二）。这无疑为推动NVIDIA进军基因组医学领域又迈出了一大步。
NVIDIA Clara团队对快速分析流程的优化 新技术的开发使得临床医生能够比以往更快地诊断疾病，并为患者提供最合适的护理。但阻碍WGS临床应用的主要障碍似乎并不在测序和分析所需的时间上，尽管快速纳米孔WGS测序在速度上创了纪录，也打破了Illumina在临床快速WGS领域的垄断地位。事实上，Illumina WGS已经“像挤柠檬一样被挤压”在提高速度。但纳米孔测序要在常规诊断中应用也面临诸多挑战，包括其准确性、成本和可扩展性等都还需要更多的应用实例来证明。即便是长达18个小时的Illumina WGS 流程对于危重患者来说仍然是高效的，可以做到第二天提供诊断。就像Kingsmore所讲的，快速WGS诊断工作流程在现实世界中广泛使用，关乎的更多是可扩展性和成本，而不是速度。其实成就速度牺牲的是成本，Euan Ashley团队论文中提到费用估算每位患者在4971到7318美元，这远高于Kingsmore团队声称的1500美元的费用（但实际上Illumina rWGS的成本可能比Euan Ashley团队的这个费用还要高）。值得一提的是，Euan Ashley团队这一破纪录的快速是多个团队配合实现的结果，需要实验室技术人员、生信人员、临床遗传学家、遗传咨询师等紧密配合，才能响应实现当天诊断。而现实世界中，这可能很难。但不管怎么样，测序技术的进步已经改变了我们诊断遗传病的方式，而这个边界还在被不断打破并往前推进。这无疑也是基因组医学最令人激动、最值得关注的领域。
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