后疫情时代，核酸扩增技术还将在这些领域发光发热...

2022-4-2 16:30| 编辑: 归去来兮| 查看: 3594| 评论: 0|来源: 检验医学

摘要: 近年来，核酸扩增检测(nucleic acid amplification testing,NAAT)技术在临床病原体检测领域的应用越来越广泛，相对于传统的培养检测方法，其缩短了检测周期、具有高灵敏度和准确度，已成为病原体检测的有效工具。

孟欢，王雅杰*

首都医科大学附属北京地坛医院检验科

近年来，核酸扩增检测(nucleic acid amplification testing,NAAT)技术在临床病原体检测领域的应用越来越广泛，相对于传统的培养检测方法，其缩短了检测周期、具有高灵敏度和准确度，已成为病原体检测的有效工具^[1]。

NAAT技术可分为DNA扩增技术和RNA扩增技术两大类。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）属于DNA扩增技术，RNA实时荧光恒温扩增技术（simultaneous amplification and testing，SAT）属于RNA扩增技术，是一种以RNA为模板扩增出RNA产物，用RNA探针实时检测的恒温扩增技术，其具有灵敏度高、检测时间短、产物不易发生污染等优点，在临床上已经得到广泛应用。本文将介绍SAT技术原理和在临用上的应用进展。

SAT技术原理

SAT技术以RNA为模板，带有T7启动子的一条引物与靶标RNA结合，在莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（M-MLV）作用下逆转录合成cDNA，形成一条RNA-cDNA双链。在M-MLV酶的RNaseH活性作用下靶标RNA链降解，另外一条引物与cDNA单链结合，在M-MLV酶的DNA聚合酶活性作用下产生一条带有T7启动子的双链cDNA。

随后，在T7RNA聚合酶的作用下，以一条DNA双链为模板可以转录出多个（100～1000）RNA拷贝，这些RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。同时，扩增体系内带有荧光标记的探针与这些RNA产物特异结合，产生荧光。

该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况，整个扩增过程都在42°C下进行。SAT技术是由RNA到RNA的循环扩增，由于RNA在环境中极易降解，可有效避免扩增产物的污染，另外，恒温扩增不需要繁琐的升降温步骤，易于实现实验仪器的自动化^[2]。

图1 SAT扩增原理图

SAT技术的临床应用

生殖道感染领域的临床应用

性传播疾病（sexually transmitted diseases，STDs）是由寄居在女性和男性生殖道的微生物引起的，已严重影响人类健康并引起社会和经济问题^[3]。

沙眼衣原体（Chlamydozoa trachomatis，CT）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）、解脲脲原体（Ureaplasm urealyticum，UU）、生殖支原体（Mycoplasma genitalium，MG）是临床上常见的STDs病原体，易引起生殖道的各种炎症和不孕不育等危害^[4]。

以往以DNA为靶标的PCR检测法是以泌尿生殖道分泌物为标本，因侵入式取样方式，患者的配合度很低。SAT法可以尿液为标本，做到非侵入式取样，减少患者痛苦^[5-8]。

以检测尿液中的CT为例，用PCR的方法需要离心尿液，得到菌体沉淀后再进行检测，如果尿液中的CT含量较少，其DNA靶标会因为低于PCR检测的灵敏度而无法检测到。但是因CT中的核糖体RNA（rRNA）的含量是DNA的数以千倍，直接裂解尿液可以释放出大量的rRNA，这样裂解液里就含有足够SAT检测的靶标RNA。因此SAT法具有高灵敏度、尿液样本取样方便等优势。

Liang等^[9]发现，在检测CT、NG和UU时，当泌尿生殖道拭子中提取的病原体载量高于103copies/mL时，PCR法和SAT法的检出率均为100%，而当病原体载量低于103copies/mL时，SAT法的检出率分别为57.14%、46.15%和80%，显著高于PCR法（28.57%、0%、0%），表明SAT法比PCR法有着更高的灵敏度，可作为STD早期诊断的有力工具。

其他多项研究显示，SAT法比培养法和PCR法的灵敏度高，此外还有检测周期短、检测下限低等优势，具有较高的临床实用性^[9-13]。

另外，童郁等^[14]发现，在UU感染的47例新患儿中，口服阿奇霉素治疗7、14、21天后，应用胶体金法、PCR法和SAT法复查，结果SAT法的转阴率显著高于前两者，这与SAT法的检测靶标为RNA，可以避免死菌DNA的干扰，只检测活菌RNA的特点相符。

其他研究^[15-18]也共同表明SAT在判断疗效上具有更高的临床应用价值，可有效防止抗生素滥用。

经过多年的临床应用，目前RNA扩增技术已被列入《梅毒、淋病和生殖道沙眼衣原体感染诊疗指南》^[19]、《WHO性传播疾病实验室诊断指南》^[20]、《淋病诊断》行业标准WS268-2019^[21]、《生殖道支原体感染诊治专家共识》^[22]、《非淋菌性尿道炎病原学诊断专家共识》^[23]等多个行业指南和共识。

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