1．固定 为了减少对标记底物结构的破坏，细胞化学样品固定的时间相对较短，多为1-3小时。环境温度一般在25°C以下。 低温固定剂一般采用2-3%甲醛与1%戊二醛。甲醛分子量小、渗透快，对蛋白质结构影响小，可较好地保存其抗原活性。但对细胞整体的细微结构保存欠佳。戊二醛对细胞的细微结构保存较好，但往往导至蛋白失去抗原活性。因此，在标记低物不是蛋白质或多肽时（如纤维素、多酚类化合物、b-1,3-葡聚糖、几丁质等），可用常规方法进行4%戊二醛和1%锇酸的双固定。 2．包埋 根据标记低物的不同，可以选择常规（常温）包埋剂或低温包埋剂包埋样品。如果标记物为蛋白质，特别是性质不稳定或不清楚时，建议使用低温包埋剂包埋，以最大程度保存抗原活性。大量实验表明，K4M是目前使用最为普遍的低温包埋剂。当选择常温包埋剂时，建议使用Spurr包埋剂。Spurr包埋剂粘性小，易渗透，易操作；包埋块不吸潮，保存时间长。 3．标记 根据标记程序的不同，标记分直接与间接标记。直接标记指胶体金探针直接与被标记底物结合；而间接标记指胶体金探针通过一或多个中间标记物后与底物结合。 直接标记 间接标记 直接标记需要制备胶体金探针，其好处是标记特异性好，背景小，能够做阴性对照。间接标记无需制备胶体金探针，可以直接购买通用二抗探针，缺点是标记特异性较难把握，背景较高，不能够做阴性对照。 在做病毒粒子标记时，直接标记法可用抗体直接富集低浓度或稀有病毒而不会增加任何背景。 影响标记的因素主要包括以下方面： （1）pH pH变化会对探针蛋白的结构与活性中心产生影响，继而影响到标记强度与特异性。在很多情况下探针作用的最佳pH值往往与该蛋白作用的最佳pH值有一定差别。例如有一种来自真菌的纤维素酶本来在pH 4.8时活性最强，但结合到胶体金上后，pH在6.0左右时最强，当pH到7.2时仍有较强的标记活性。 （2）离子环境 有些蛋白只有在一定离子环境中才有生物活性，其中很多涉及Ca2+，Mg2+，Mn2+，Cu2+等阳离子。有时溶液中Ca2+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而导至标记失败；因此，在配制标记溶液时要注意各种阴阳离子的配伍，添加顺序及溶液pH。 （3）温度 标记温度对标记活性及特异性影响最大，也最容易出问题。以水解酶类做成的胶体金探针对温度变化也更为敏感，不同温度、不同时间标记出的切片其视觉效果完全不一样。在此特别指出一点，在用内切的水解酶探针时，切忌温度过低，时间过长，否则会出现标记的扩散现象。建议在可能时尽量使用外切酶探针。 在使用IgG或Protein A，Protein G探针时，有人认为在4℃下长时间标记特异性最好。但我们研究发现事实并非如此，在25℃以上的室温下标记20-60 min其特异性更好。 一般来说，如果用来自植物或微生物的蛋白做探针，标记温度最好在25℃左右；用来自动物的蛋白做探针时，标记温度最好在30℃左右。 （4）封闭液组成 封闭液对封闭有关非特异性活性基团，特别是醛基至关重要。在多数情况下封闭液与探针重悬浮液、标记溶液是一样的。目前最常用的封闭液组分有BSA、卵清蛋白、脱脂奶粉、PEG20000等。在用IgG、Protein A、Protein G等标记时，应优先选用BSA(组分五)；在植物凝集素类探针标记时，应优先选用PEG20000。也有人发现IgG探针标记时脱脂奶粉最佳。 如果是用交联蛋白做成的探针，那么封闭液中最好有载体蛋白的成分。 4．样品的低温包埋的基本程序 (1) 将新鲜样品切成1×1×3 mm3的小块，立即放入3%甲醛和1%戊二醛的磷酸缓冲液(100 mM, pH 7.2)中4°C下固定2 h； (2) 在4°C依次用30%、50%乙醇溶液脱水，每步30 min； (3) 在-20°C冰箱中依次用50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脱水，每步60 min；（注意乙醇溶液首先在冰箱中预冷！） (4) 在-20°C冰箱中依次用30%、70%、100%的K4M渗透，每步120 min；注意不断轻轻摇动样品使渗透完全。 (5) 在4°C K4M树酯包埋。注意包埋剂应尽量装满，否则气泡中的氧气会抑制包埋剂的聚合。 (6) 在-20°C冰箱中长紫外线照射聚合72 h。室温下聚合48 h。注意每天翻动2次样品使紫外光照射均匀。 (7) 聚合后的样品应及时切片，长时间放置会导至样品与包埋剂之间分离而无法切片。 (8) 超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记。 与其它标记用包埋剂相比，K4M可在-35°C低温下仍保持较低的黏度；K4M有极性，亲水，易脱水，易标记；聚合后交联度高，易切片。 K4M的配方根据材料的性质确定。植物或坚硬的材料包埋剂的硬度要高；动物或幼嫩材料包埋剂的硬度要低。具体参见包埋剂说明。 注意： (1) K4M有毒，须带PVC或PVDV手套谨慎操作。溅入眼睛或皮肤时请立刻用清水冲洗。 (2) 所有脱水乙醇须提前预冷。 (3) 脱水过程中防止样品结霜吸潮。 5．样品常温包埋（常规）的基本程序 （1） 将新鲜样品切成1×1×3 mm3的小块，立即放入4%戊二醛的磷酸缓冲液(100 mM, pH 7.2)中4°C下固定6－12 h； （2） 样品用磷酸缓冲液冲洗3次每次5 min；然后在2%锇酸溶液中固定1 h；冲洗3次，每次5分钟。（通风橱中戴手套进行，含锇酸废液倒入食用油中！） （3） 在4°C或室温下依次用30%、50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脱水，每步15 min； （4） 依次用30%、70%、100%的Spurr包埋剂渗透，每步120 min；然后在100%的Spurr包埋剂中过夜。 （5） Spurr包埋剂包埋。可包埋在0.5 ml的离心管中，每管加0.3 ml包埋剂即可。加入纸标签。 （6） 在70°C温箱中聚合12－16 h。 （7） 聚合后的样品可长时间保存。超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记。 6．胶体金直接标记基本程序 (1) 在培养皿中铺上石蜡膜(parafilm)；四周加吸水纸和水以保湿； (2) 加一滴dd H2O，镍网切片向下漂浮2 min； (3) 另滴50 ml封闭液(BL)，将镍网切片向下漂浮30 min； (4) 另滴50 ml封闭液(BL)，加入2-3 ml胶体金探针，充分混匀；将镍网切片向下漂浮30 min； (5) 标记后镍网的在dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗3次，每次5-10 min；晾干； (6) 常规染色，观察。 7．胶体金间接标记基本程序 (1) 镍网切片向下在dd H2O上漂浮2 min； (2) 在封闭液(BL)上漂浮30 min； (3) 把一抗用BL稀释100-500倍，将镍网切片向下漂浮30-60 min； (4) dd H2O漂洗两次各5 min，除去多余一抗； (5) 在封闭液(BL)上漂浮30 min； (6) 用胶体金探针标记30 min； (7) dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗3次，每次5-10 min；晾干； (8) 常规染色，观察。 8．利用胶体金间接标记法进行双标记的基本程序 (1) 镍网切片向下在dd H2O上漂浮2 min； (2) 在封闭液(BL)上漂浮30 min； (3) 把一抗A用BL稀释100-500倍，将镍网切片向下漂浮30-60 min； (4) dd H2O漂洗两次各5 min，除去多余一抗A； (5) 在封闭液(BL)上漂浮30 min； (6) 用小颗粒胶体金探针A标记30 min； (7) dd H2O漂洗两次各5 min，除去多余胶体金探针A； (8) 重复步骤(2)-(7)，其中抗体和探针改用一抗B和大颗粒胶体金探针B； (9) dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗3次，每次5-10 min；晾干； (10) 常规染色，观察。 9．利用胶体金直接标记法进行双标记的基本程序 如果两种探针的重悬浮液相同（如同为IgG-gold），可直接混合，按上述5的方法进行。单混合时大颗粒胶体金的量要适当增加。 如果两种探针的重悬浮液差别较大，可分别进行直接标记。步骤如下： (1) 镍网切片向下在dd H2O上漂浮2 min； (2) 在封闭液1上漂浮30 min； (3) 用胶体金探针1标记30 min； (4) dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗2次，每次5-10 min； (5) 在封闭液2上漂浮30 min； (6) 用胶体金探针2标记30 min； (7) dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗3次，每次5-10 min；晾干； (8) 常规染色，观察。 10．直接法标记粗提纯病毒 (1) 取新覆膜镍网，在用BL稀释500倍的病毒抗血清上漂浮3 min； (2) 在病毒溶液上吸附10 min； (3) BL封闭30 min； (4) 一抗胶体金探针标记30-120 min； (5) 水洗3次，每次5-10 min； (6) 2%醋酸双氧铀负染。 注意： (1) 如果使用间接标记方法，不能采用或只能采用高度稀释的抗体吸附病毒。否则，高强度的标记背景影响正确判断。 (2) 该方法允许多探针直接混合一步法同时标记多种病毒。特别适应于对未知病毒的检测。 |
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