转录介导的核酸扩增技术小结

01

国外发展历程

1.转录依赖的扩增系统(Transcription-based amplification system,TAS)

      1989年，DY Kwoh等首先提出了依赖转录的扩增技术——TAS，该技术的扩增过程包含两个步骤，第一个步骤通过逆转录形成cDNA，第二个步骤通过转录形成大量的RNA。该技术的反应步骤如图1所示，首先带有RNA聚合酶结合序列的引物A与变性后的RNA或DNA结合，在AMV逆转录酶的作用下形成cDNA；经加热变性后，继续补充逆转录酶，cDNA与引物B结合并在逆转录酶作用下形成双链DNA；双链DNA上的RNA聚合酶结合序列可被RNA聚合酶（如T7、T3或SP6）识别并启动转录产生RNA；形成的RNA又可作为模板，同样在逆转录酶和RNA聚合酶作用下，分别形成cDNA和RNA。扩增产生的单链RNA可用于杂交检测。

2.自主序列复制(Self-sustained sequence replication,3SR)

      1990年，Guatelli JC等在TAS的基础上加入RNaseH，使得反应可在恒温条件下进行循环扩增。该技术的反应步骤如图2所示，模板RNA与带有T7 RNA聚合酶启动子序列的引物A结合，在AMV逆转录酶作用下形成RNA·DNA杂合链，RNase H降解杂合链中的RNA形成cDNA；cDNA再与同样带有T7 RNA聚合酶启动子序列的引物B结合，并在AMV逆转录酶作用下形成双链DNA；该DNA的一端带有完整T7转录启动子序列，可与T7 RNA聚合酶结合转录产生RNA，该RNA与模板RNA序列互补，定义为反义RNA；反义RNA可作为模板进入循环扩增；由于引物A和B均带有T7 RNA聚合酶启动子序列，因此在扩增过程中会形成两端均带有T7转录启动子序列的双链DNA，该DNA可在T7 RNA聚合酶作用下产生正义RNA和反义RNA，形成自主循环过程。

3.依赖核酸序列扩增技术(Nucleic acid sequencebased amplification,NASBA)

      1991年，J Compton在3SR基础上改进后提出了NASBA，该技术同样依赖AMV逆转录酶、RNase H 和T7 RNA聚合酶以及一对引物来完成等温扩增。不过，NASBA 体系中加入了DMSO，使得反应温度由37℃提高到41℃，可有效提高反应的特异性。其扩增过程包含非循环相和循环相（见图3）。在非循环相中，DNA或RNA经变性后首先与带有T7转录启动子序列的引物1结合，再在AMV逆转录酶和RNase H以及另一条引物2的参与反应中，形成带有T7转录启动子序列的双链DNA，该DNA可与T7 RNA聚合酶结合并转录形成反义RNA；反义RNA即可进入循环相作为模板，在3种酶和2条引物的共同作用下形成越来越多的反义RNA。

4.依赖转录介导扩增(Transcription mediated amplification,TMA)

      1995年，Gen-Probe推出TMA（见图4），使用带有RNaseH活性和逆转录酶活性的MMLV 逆转录酶取代AMV逆转录酶、RNase H两种酶。Gen-Probe还结合其研制的杂交保护试验（Hybridization Protection Assay，HPA）对TMA产物RNA进行检测（见图5），开发出了一系列产品。该技术主要检测原理为：模板RNA经MMLV逆转录酶逆转录形成带有T7转录启动子序列的双链DNA，再由T7 RNA聚合酶转录成大量RNA；产物RNA可与丫啶翁酯（acridinium ester，AE）标记的DNA探针（图5A）杂交形成双螺旋而保护AE不被水解，从而可由光度计检测获得阳性信号（图5C）；如探针不能和产物杂交，AE则会被选择性除去，光度计检测结果便为阴性（图5B）。Gen-Probe目前已被HOLOGIC收购，其在后续的发展中，整合推出了集合样本处理、核酸捕获、扩增检测和产物灭活的Panther^®系统。

02

国内发展情况

1.RNA实时荧光恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing,SAT)

       SAT为上海仁度对转录介导的扩增技术改进后的RNA 扩增实时荧光检测技术，其检测过程中采用了分子信标作为荧光探针，靶标RNA在扩增过程中可形成实时检测的信号（见图6）。该公司也结合磁珠捕获探针法（图7），整合成一套全自动核酸检测分析系统（AutoSAT），该系统可以实现核酸提取、扩增、检测、结果分析全程自动化流水线式检测，可搭载RNA 实时荧光恒温扩增技术平台的全系列试剂产品。

2.双扩增法(Dual Amplification)

       双扩增法由T7线性扩增和多生物素信号放大两种技术组成，武汉中帜基于该技术已经推出了呼吸道病原体多联检产品。该技术的T7线性扩增部分与上述厂家大体相同，主要差别在于对扩增产物RNA的检测。其检测原理如图8所示：T7线性扩增形成的RNA产物加入到包被有包被探针的微孔里，与各探针（CES探针、LES探针、放大探针）杂交，形成CES探针-RNA产物-LES探针-放大探针复合物，并通过包被探针固定在微孔板上；放大探针上标记的生物素可与HRP-链霉亲和素酶联物结合，进一步形成CES探针-RNA产物-LES探针-放大探针-HRP-链霉亲和素酶联物，并固定在微孔板上；而辣根过氧化物酶（HRP）可催化底物显色，继而通过化学发光检测仪测定获得结果。

03

总 结

       转录介导的核酸扩增技术自发表以来，已有30多年历史，其在国外上的发展过程总体上是按照简化操作、提高检测灵敏度和特异性、实现自动化操作的方向进行的。由原来在循环扩增过程中需要通过加热变性到实现恒温扩增，再到提高反应温度增加特异性并可保证多个酶的反应效率，最后结合核酸捕获和产物分析等技术实现了全自动检测流程。国内基于该技术的两个厂家也在朝着各自的方向改进发展，上海仁度基于磁珠捕获探针法和实时检测法，实现了该技术的全自动操作流程，检测时间短，但受限于检测荧光通道数，目前还未有多重检测产品上市；武汉中帜的双扩增法，在检测步骤可通过微孔板不同孔内的捕获探针实现多重检测，其多生物素信号放大技术可能也部分弥补了多重检测灵敏度偏差的不足，但操作步骤较为繁琐。

参考文献

[1] Kwoh DY, Davis GR, Whitfield KM, Chappelle HL, DiMichele LJ, GingerasTR. Transcription-based amplification system and detection of amplified humanimmunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format.Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Feb;86(4):1173-7. doi: 10.1073/pnas.86.4.1173.PMID: 2919166; PMCID: PMC286648.

[2] Kwoh DY, Davis GR, Whitfield KM, Chappelle HL, DiMichele LJ, GingerasTR. Transcription-based amplification system and detection of amplified humanimmunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format.Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Feb;86(4):1173-7. doi: 10.1073/pnas.86.4.1173.PMID: 2919166; PMCID: PMC286648.

[3] Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification.Nature. 1991 Mar 7;350(6313):91-2. doi: 10.1038/350091a0. PMID: 1706072.

[4] Hill CS. Molecular diagnostic testing for infectiousdiseases using TMA technology. Expert Rev Mol Diagn. 2001 Nov;1(4):445-55. doi:10.1586/14737159.1.4.445. PMID: 11901859.

[5]上海仁度, 首次科创板上市发行招股书.

[6]李先强, 姜昕, 厉洁,等. 用于同时检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒及其应用: CN110964854A[P]. 2020.