多肽生物分析样品制备的主要挑战

您能否介绍一下肽生物分析——什么、为什么、如何？

那么让我们来谈谈肽和蛋白质。在过去的十年中，由于生物制剂的疗效提高和副作用减少，生物制剂在制药管道中的比例发生了重大转变。随着大分子疗法的这种转变，该行业发现自己正处于许多关键生物制剂的专利到期中。例如，治疗性肽药物 Byetta、Forteo 和许多胰岛素类似物，如 Lantus 和 Levimar。对于基于蛋白质的药物治疗，我们谈论的是基于单克隆抗体 IgG 的蛋白质，如曲妥珠单抗（赫赛汀）和英夫利昔单抗（Remicade）。大分子生物疗法的这种转变导至生物分析实验室、创新制药公司、CRO 以及生物标志物研究实验室更加关注它们的量化。

要真正了解肽的治疗潜力，必须采用正确的生物分析策略和技术，这也是当今播客的重点。在接下来的几分钟内，我将讨论并为您提供成功进行肽类生物分析所需的基本工具/策略和知识，最终目标是简化从研究小分子到大分子的转变。今天，我想讨论生物分析科学家在开发灵敏且稳健的基于 LC-MS 的方法来分析生物基质（如血浆、尿液、CSF 等）中的大分子、肽和蛋白质时所面临的挑战。

用于LC-MS 生物分析的肽样品制备过程中面临的最大挑战是什么？

这是一个很好的问题，因为我们已经看到在过去十年中使用的治疗生物方法的数量增加了，分析这些生物制剂以支持药物发现和开发的需求也急剧增加，特别是在支持 ADME/DMPK 研究时。而这给典型的小分子生物分析实验室带来了新的挑战。具体而言，必须开发灵敏、选择性和稳健的新生物分析方法。理想情况下，这些也符合当前的监管标准。

使用 LC-MS 成功定量蛋白质和肽通常比小分子疗法或模式更具挑战性。由于其庞大而复杂的结构，开发灵敏且稳健的肽/蛋白质分析方法通常需要更多的专业知识，并且由于这些分子经常遇到的各种挑战，可能需要更多的方法开发。由于生物分子（如肽和蛋白质）的大小、电荷状态分布和复杂的 MS/MS 碎裂，质谱法的灵敏度可能低于典型的小分子，通常需要更高的 LC 和样品制备方法开发。

具体来说，根据我为这些生物分子开发端到端分析的经验，挑战从分析前处理开始，一直到样品提取、色谱和 MS 方法开发。我们经常遇到的典型挑战是在整个样品制备和分析过程中保持溶解度的问题，有效地破坏生物基质中生物分子的蛋白质结合，这些分子与其接触的任何表面的非特异性结合（或吸附），这最几乎总是会导至分析物的损失和测定性能的更高可变性。通常，由于这些内源性或治疗性生物分子来自 20 个有限氨基酸，因此我们经常会遇到更多的基质干扰，因此我们需要实现更高的检测特异性。最后，分析物回收率低，这是未能成功破坏非特异性或蛋白质结合的最常见症状。当我们将所有这些放在一起时，如果无法成功应对或克服这些挑战，通常会导至检测的分析性能不够理想：缺乏灵敏度、有限的特异性、缺乏稳健性或更高的可变性（CV 或 RSD）。

为什么在尝试分析肽时应该关注蛋白质结合？

好吧，当专门考虑样品制备时，在固相萃取 (SPE) 之前未能有效地从生物基质中破坏生物分子，将导至蛋白质结合的肽通过吸附剂，在样品初始加载期间由于尺寸排阻而未保留机制。

出于这些原因，在我们的实验室中，我们经常花时间评估各种有效的预处理策略，例如用强酸（如 4% 磷酸）或 5% 氢氧化铵溶液作为起点进行稀释。甚至对更具挑战性、更大和疏水性的肽变得更具攻击性。在这里，我谈论的是用 1:1 甲醇或乙腈进行有机预处理，或用胍、尿素或十二烷基硫酸钠 (SDS) 进行变性作为有效破坏蛋白质结合的有效手段。如果我们成功地做到了这一点，我们就会通过萃取（驱动灵敏度）本质上提高分析物的回收率。

什么是非特异性结合以及它如何影响定量性能？

当我们谈论非特异性结合或 NSB 时，我们指的是肽或蛋白质粘附或倾向于结合或吸附到其接触的任何表面的倾向，例如玻璃、收集容器、移液器吸头、LC 流体等。浓度越低，可能发生的分析物损失越多。此外，这里的挑战是很难预测 NSB，因为它受肽的性质和大小、稀释剂或生物分子溶液的有机成分以及浓度的影响。因此，很自然地，如果分析物受到 NSB 的影响，我们经常会发现我们的整体分析会受到影响。当我们谈论 5 个关键挑战时，我们经常看到的症状是灵敏度差、LOD 较高（由于损失）、色谱问题（峰形不佳或根本没有）、非线性、

您可以采取哪些策略来减少非特异性结合？

首先，我们要考虑溶解度，确保生物分子从最初溶解，从粉末到样品提取和 LC-MS 分析，将最大限度地减少或减轻 NSB 的严重性。出于这个原因，我们通常建议将有机物浓度限制在不超过 75%，因为肽通常会在所有有机物中沉淀，并使用有机改性剂，如酸或碱（1-10% 之间）来促进和保持溶解度。这在 SPE 样品制备中变得尤为重要。

与溶解度一样重要的是我们使用的收集容器的选择。无论是使用纯标准溶液还是低浓度的提取样品，选择不会通过 NSB 机制导至肽损失的收集容器至关重要。在这里，我们谈论的是干净整洁的标准品或经过高度纯化的加工样品，不含蛋白质或其他成分，可以防止生物分子粘在容器上并丢失。

我们这里的部分策略是使用低绑定消耗品。对我们来说，NSB 的这个问题是通过使用 QuanRecovery 样品瓶和 96 孔板来解决的。这些板和样品瓶专为 LC-MS 分析而设计，以减少由于离子相互作用和与样品容器的非特异性结合而导至的生物分子样品损失。它们以自动进样器就绪格式提供，残留样品量低，可最大限度地利用样品。使用低结合耗材可确保我们最大限度地减少自动进样器的损失，确保我们的检测具有高回收率和可重复性。

如何从血液/血浆中分离和净化浓缩肽？

虽然最广泛接受的生物分析提取技术是使用有机溶剂的蛋白质沉淀 (PPT) 和液-液提取，但就实现回收率或重现性而言，这些通常不足以进行样品净化。很自然地，一旦您开始对肽和蛋白质有更多的了解，很明显这通常是由于我们已经讨论过的问题：由于肽与基质中的其他蛋白质一起沉淀，PPT 的回收率很差。

因此，使用反相和混合模式的固相萃取提供了额外的好处。允许以高回收率（通常大于 75%）和高选择性从基质中有效和选择性地纯化肽。此外，当使用混合模式萃取（使用阳离子或阴离子交换）时，我们现在可以增加比 RP SPE 更高的选择性。它增加了整个分析的正交性，在混合模式下进行样品制备，在 RP 下进行 LC。此外，我们可以利用微量洗脱形式将直接洗脱用于提取的样品浓缩至低至 25uL，无需蒸发和重构，最大限度地减少由于蒸发吸附或干燥而导至的分析物损失重新配制时样品或溶解性差。

如何防止低回收率？

正如我们今天讨论的那样，在生物分析工作流程中防止肽损失或低回收率的大部分工作都是从了解关键挑战开始的：注意肽的溶解度以避免因 NSB 造成损失。因此，您可以使用含有甲酸或氢氧化铵等改性剂的混合溶液或有机/水溶液，以确保正确电离并保持溶解度。此外，确保适当的预处理，这有效地破坏了蛋白质结合，以从您的生物基质中完全恢复您的肽。在微量洗脱形式中使用混合模式固相萃取也可用于确保高分析物回收率和样品浓度，以提高选择性和检测限，最后使用适当的样品收集容器，如QuanRecovery 样品瓶和板，