分子技术丨PCR电泳技术介绍

今天，我们聊一聊PCR电泳技术。首先，我们先了解什么是PCR技术？

PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）,一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

1983年美国Kary Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生，1993年Kary Mullis因发明PCR方法获得诺贝尔化学奖。

△Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry (1993)

PCR的原理：PCR的基本过程类似于DNA的天然复制，特异性依赖于与靶序列两端互补的Oligo引物。整个过程由变性-退火-延伸3个基本反应步骤构成：

1，模板DNA变性：模板或经PCR扩增形成的DNA经加热至94℃左右一定时间后，双链之间氢键断裂，双股螺旋解链，变成两条单链，以便它与引物结合，为下一轮反应做准备。

2，模板DNA与引物的退火（复性）：DNA加热变性成单链后，当温度降至一定程度（55℃左右）时，引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合。

3，引物的延伸（72℃）：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP为原料，按A-T、C-G碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA链互补的链。

重复上述 变性-退火-延伸 的循环过程，每一循环获得的“半保留复制链”都可成为下次循环的模板。通常每完成一个循环需时为2~4min，2~3h就能将靶核酸扩增放大上亿倍（30个循环时，靶产物数量约为10亿）。（注：PCR的第1和第2个循环，并没有短的目的片段，只是在第3个循环后才有，并且有部分双链的长片段将始终伴随整个扩增过程）

△PCR的扩增原理

比如现在有一名高血压患者，我现在要做高血压个性化用药基因检测（点击查看），拟选择卡托普利进行降压，那么需要对ACE I/D突变进行检测。经过引物设计（点击查看），最终的野生型目的片段约在200bp左右，由于突变型的目的片段比野生型的多了287bp的插入，那么突变型的片段约在500bp左右。

△ACE I/D 16号内含子中存在的287bp插入

DNA经过PCR的扩增后，我们对扩增的产物进行电泳检测，DNA凝胶电泳所需的标准琼脂糖浓度一般为1.0%。浓度越高，小条带的分辨率越高；反之，琼脂糖浓度越低，大分子量条带的分辨率和分离程度越高。

在电场中，中性pH值缓冲液（TAE/TBE）下DNA都带净负电荷并向凝胶装置正极(+)方向移动（下图中，上为“-极”至下为“+极”），DNA分子越大则所受阻力越大，也越难在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢，比如500bp的DNA分子比200bp的DNA分子迁移就慢。

此外，电泳时需要将DNA与荧光染料混匀，结合染料后，DNA会在紫外灯下发出荧光，这样才会出现下图中的亮色条带，常用的染料有EB（溴化乙啶）、gel red、sybrgreen1等（有钱建议不要用EB，因为有毒）。

在电泳结束后进行结果解读，我们无法直接判断DNA的长度，所以需要在电泳过程将DNA产物与DNA标准品（DNA Marker）一起跑电泳，DNA Marker里面含有若干种长度已知的DNA（下图中出现6条亮带的就是DNA Marker），通过与之比较可以粗略判断DNA样品的长度。同时DNA Marker中的DNA片段浓度已知，通过与DNA Marker的亮度进行比较也能初步判断DNA样品的浓度。

结果解读：通过与DNA Marker比较，如果是野生型，那么就是左边这个图，可发现DNA片段长度大小约为200bp，如果是突变型，那么就是右边这个图，突变有纯合突变和杂合突变两种，中间一条500bp的条带即为纯合突变，最右边的200bp及500bp两条条带即为杂合突变，通过PCR及简单的电泳法便可准确的进行ACE I/D的检测。

△ACE I/D电泳结果

优点：

1，操作简单；

2，时间较快；

3，实验设备比较普及；

4，成本低。

缺点：

1，通量低；

2，检测局限性；

3，部分结果不容易判断。

此方法适宜于硬性条件不好的实验室进行低通量的分子检测。