分子技术丨RFLP检测技术介绍

今天，我们聊一聊PCR-RFLP技术，上一篇我们已经介绍过PCR电泳技术，两者主要原理类似，只是实验中多了一步“限制性内切酶的剪切”，首先，我们先了解下什么是RFLP技术？

RFLP：限制性片段长度多态性（Restriction Fragment length Polymorphism，RFLP），是一种基于PCR扩增和限制性内切酶特异识别序列并切割的基因分型方法。该法不依赖自动化设备，是实验室对较少量的标本进行基因分型的实用方法。

限制性内切酶通常可以特异性识别双链DNA的某一段序列，并在特定位置或附近进行DNA双链切割，进而产生短的DNA片段。由于限制性内切酶识别序列的严格性，识别序列发生一个碱基的变化都使得酶切位点不能被酶切，从而保持原有序列长度（原理见下图）。

Pst I酶的识别序列和酶切切口

RFLP法用于基因分型时，限制性内切酶的识别序列选择主要依据SNP位点上的已知等位基因，根据待测的SNP等位基因和位点附近序列，查找符合序列的限制性内切酶。设计引物扩增含有SNP位点的DNA片段。当限制性内切酶与PCR产物共同孵育时，该酶将仅识别一个等位基因（野生型或变异型），然后在该位点切割DNA分子。依据个体携带的等位基因不同，酶切可以产生不同的切割片段，应用凝胶电泳，通过DNA片段大小判断SNP基因型。

RFLP检测原理

比如现在需要研究柔红霉素药物浓度的相关基因，拟选择对ABCC1 基因的Arg723Gln位置进行检测分析（2168G>A, rs4148356 ）。（今天的实例比较有特点）

daunorubicin浓度与Arg723Gln关联性

当我们知道需要检测的位点后，RFLP的检测流程大致分以下三步：

1，选择合适的限制性内切酶，该酶能够特异性识别SNP位点的碱基种类，当SNP位点碱基变化时，能够使该酶失去原有的识别位点；

2，设计扩增引物，将包含SNP位点的一段DNA扩增下来，且保证其中只有一个该酶的识别位点；

3，使用限制性内切酶对产物进行酶切、电泳，通过产物带型来确定SNP的碱基种类。

首先，通过NCBI查找rs4148356位点的序列，选择合适的限制性内切酶；并在UCSC数据库中下载ABCC1基因序列，准备下一步引物设计。

rs4148356位点的序列找出后，我们在WatCut（SnapGene软件可能更直观）软件中查找此位置的内切酶，可惜并没有找到合适的位点内切酶（见下图）。

Arg723Gln的限制性内切酶选择

我们知道RFLP的技术方法不能适用于所有SNP位点分型，因为并非所有SNP位点均能找到合适的限制性内切酶，那么Arg723Gln是否可以用RFLP来检测呢？答案是可以的，接着往下看。

如果没有合适的酶切位点，我们是否可以将引物设计在酶切位点附近，并在引物上做一些修改呢？于是，我们先设计引物，并使上游引物的3’端靠近检测位置，3’端碱基不能修改，因为Taq DNA酶必须在引物3’末端与模板完全互补情况下才能进行有效的聚合反应，那我们在倒数第二个碱基位置进行修改（下面中绿色的C位置），将C变成T，以期找到合适的内切酶。（产物长度为150~1000bp，且酶切位点左右序列长度差异＞100 bp以保证电泳带型明显）

Arg723Gln的引物修改

修改完成后，我们再次将序列导入WatCut软件中查找内切酶，可以发现此时出现了我们需要的内切酶，此时我们可选择Ags I酶和Taq I酶都可以，因为我们修改过一个碱基，此时选择Taq I酶进行实验，因为Taq I酶剪切T CGA位置：

引物修改后出现可选择内切酶

为了验证此RFLP方法是否可行，检测结果将RFLP法与Sanger法进行了对比（见下图），如果是野生型，那就是T CGA，可以被Taq I酶剪切，结果便会出现132bp及25bp两条带；如果是纯合突变型那就是T CAA，不可被Taq I酶剪切，结果便会出现一条157bp条带；如果是杂合突变型，那就是T CGA和T CAA共存，一半可被Taq I酶剪切一半不可被Taq I酶剪切，结果便会出现132bp、25bp及157bp三条带。通过PCR-RFLP法便可准确的进行Arg723Gln的检测。（今天的实例比较特殊，有些SNP的位点很好选择限制性内切酶的）

RFLP法与Sanger法

优点：

1，操作简单；

2，无需探针标记；

3，实验设备比较普及；

4，成本低。

缺点：

1，通量低；

2，部分SNP无合适限制性内切酶；

3，部分结果不容易判断。

4，时间较长，目前市场较少见。

此方法适宜于硬性条件不好的实验室进行低通量的分子检测。