日本溶瘤病毒治疗:临床试验进展和未来展望

利用基因工程在肿瘤细胞中选择性复制溶瘤病毒有望成为治疗癌症的新药物(图1)。T-VEC (talimogene laherparepvec;IMLYGIC;以前称为OncoVEX GM-CSF),第二代溶瘤单纯疱疹病毒1型(HSV-1),在2015经美国食品和药物管理局(FDA)批准被用于治疗不能手术的黑色素瘤，随后在2016年时被欧洲药品局(EMA)批准。除了T-VEC,多个使用不同亲本的溶瘤病毒在进行三期临床试验:Pexa-Vec (pexastimogene devacirepvec;以前被称为JX-594)，一种溶瘤痘苗病毒 (NCT02562755 [PHOCUS])，CG0070，一种溶瘤腺病毒 (NCT01438112 [BOND]和NCT02365818 [BOND2])，以及REOLYSIN (pelareorep)，一种溶瘤腺病毒(NCT01166542)。截至2018年5月，日本已经研制出几种溶瘤病毒，其中一些已经进入临床试验阶段。例如,G47Δ,第三代溶瘤细胞1型单纯疱疹病毒,已经在针对多种恶性肿瘤包括神经胶质瘤胚细胞瘤,前列腺癌和嗅觉神经母细胞瘤(UMIN000002661、UMIN000015995 UMIN000010463和UMIN000011636) 的I期和/或II期临床试验中。在这篇综述中，我们总结了已经开展或目前正在进行的溶瘤病毒治疗临床试验，针对每种亲本病毒(HSV-1、腺病毒和仙台病毒)，并讨论了未来的前景。

HSV-1是一种包膜双链DNA病毒，具有作为溶瘤病毒使用的几个优点。HSV-1的全基因组序列是于1988年测定的，其大部分基因功能已被鉴定。此外，HSV-1基因组的大小相对较大(约152kb)，适合多种转基因的插入。此外，HSV-1基因组高度稳定，不能整合到宿主基因组中，因此不致癌。1型单纯疱疹病毒以可以感染神经细胞而著名,但它同样能够感染各种各样的人类细胞,由于其高增殖能力所以可以能到较高的病毒滴度。此外,anti-HSV-1的可用性,如阿昔洛韦、更昔洛韦,提供了额外的安全机制。因此, HSV-1的溶瘤病毒以及基于腺病毒的治疗策略已被广泛研究，并且是这种治疗类别的支柱。在日本，三种溶瘤性HSV-1治疗已经在临床试验中。

T-VEC是第一个在欧洲和美国被批准的溶瘤病毒药物。它删除了γ34.5和α47,表达了人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。根据其基因缺失数（2），将其分类为第二代溶瘤性HSV-1。这个病毒γ34.5的删除主要促进了癌症选择性复制和毒力衰减。由于γ34.5基因的主要功能是当宿主细胞被病毒感染之后，可以促使其蛋白质合,所以当γ34.5基因被删除之后，病毒在正常细胞内无法复制。然而,由于癌细胞蛋白合成反应有缺陷，γ34.5-删除的病毒仍然可以在癌细胞内复制(即cancer-selective复制)。α47基因能抑制宿主细胞抗原表达相关转运子(TAP);因此，它的缺失导至MHC I类的持续表达，这将增强宿主的抗肿瘤免疫反应。此外,α47的删除导至US11位于α47启动子的控制下,导至癌细胞的病毒复制功能增强。T-VEC的GM-CSF表达可能增强抗肿瘤免疫，但尚未有令人信服的临床前证据。

在多个I/II期试验显示T-VEC的安全性和可能的有效性之后，我们对不可切除的IIIB–IV期黑色素瘤患者进行了三期随机临床试验。研究随机选取436例患者，以2:1的比例进行病灶内T-VEC或皮下GMCSF治疗，结果显示T-VEC组较GM-CSF组有明显更高的耐受反应率(客观反应持续≥6个月)。值得注意的是，当T-VEC作为IIIB、IIIC或IVM1a期亚组患者的一线治疗药物时，中位总生存率也显著延长。这项研究是第一个能证明病灶内注射溶瘤病毒不仅可以抑制肿瘤的生长也可以延长总生存期,推测原因是增强了全身抗肿瘤免疫力。这些有前景的结果加速了美国食品及药物管理局和EMA的最终批准。

在日本,2017年2月，一项评估T-VEC治疗不可切除期IIIB IV恶性黑色素瘤的安全性和有效性的多机构I期研究开始招募参与者(表1)(NCT03064763)。在研究中，T-VEC将在超声引导下或无超声引导下注射到皮、皮下或结节性肿瘤内。首次注射10⁶ 血小板形成单位PFU/ml，三周后给予标准剂量10⁸或10⁷ (PFU)/ml，此后每2周给予一次。

G47Δ是第三代溶瘤细胞1型单纯疱疹病毒(包含三个突变)，是由Todo等人在2001年通过它的前身病毒G207添加额外突变得到的。第二代溶瘤病毒 HSV-1 G207是由Mineta等人于1995年研制成功的;它删除了γ34.5基因，在ICP6基因内插入了大肠杆菌LacZ基因。ICP6基因编码核糖核苷酸还原酶(RR)的大亚基，这是病毒DNA合成所必需的。ICP6缺失的病毒只能在分裂细胞中复制，如肿瘤细胞，这些细胞表达足够的哺乳动物RR来补充病毒突变。此外，插入LacZ可以方便地检测感染组织中含有病毒的细胞。G207是第一个在美国进行临床试验的溶瘤性HSV-1。无论是单独给药还是联合放疗，其安全性和潜在的抗肿瘤活性都在胶质瘤患者中得到了证实。

G47Δ是由G207删除了α47之后得到的,它显示出高于G207的抗肿瘤疗效。如前所述,α47缺失增强复制能力和系统抗肿瘤免疫力。尽管G47Δ和T-VEC有一样的突变 (α47和γ34.5),G47Δ比T-VEC更容易衰减，由于它删除了ICP6基因，因此也比两个突变的病毒如T-VEC和G207更安全。在临床前研究中,G47Δ在几乎所有的癌症类型和实验模型(30、35 48)中都表现出了抗肿瘤功效。基于其有效性和高安全性,G47Δ迄今为止在日本进行了四个临床试验，是目前唯一应用在人类身上的第三代HSV-1。

G47Δ的第一阶段临床试验用于治疗复发胶质母细胞瘤患者，在东京大学内进行，从2009年到2014年。G47Δ注入人类的大脑(UMIN000002661)证明了其结果的安全性。随后2015年在东京大学进行了二期临床试验，为了测试在残留或复发胶质母细胞瘤患者中G47Δ的有效性 (UMIN000015995)。在本研究中，1x109 PFU的剂量在两周内两次注射入脑肿瘤，之后每四周一次，最多6次;到目前为止，该疗法的耐受性良好，研究正在按计划进行。2016年2月,G47Δ被日本卫生部、劳动和福利部指定为Sakigake突破治疗药物，允许(PMDA)优先审查和快速药物批准。除了胶质母细胞瘤的临床试验,2013年，东京大学开始了一项针对阉割抵抗性前列腺癌(UMIN 000010463)患者的单臂一期研究，以及另一项针对复发性嗅觉神经母细胞瘤(UMIN 000011636)患者的研究。在前列腺癌的试验中, 使用超声波引导的技术将3x 108微升G47Δ反复(2-4循环)注射到9个病人的前列腺中 (UMIN000010463)。这项研究是在2016年完成的,其结果表明G47Δ注入前列腺中是安全的。嗅觉神经母细胞瘤的试验目前正在进行中，目标人群为10名患者(UMIN 000011636)。除了上述四个临床试验, 2018年3月,东京大学批准了G47Δ治疗恶性间皮瘤的研究。

HF10，也被称为Canerpaturev (C-REV)，是从非神经侵袭性HSV-1株HF克隆而来的非选择性克隆(即自然变异，而非基因工程)。该病毒在UL和UL/IRL连接的右端缺失3.9 kb，导至UL56表达缺失。据报道，HF10的复制毒性较低，比野生型1型单纯疱疹病毒更有效。基于几项临床前研究的良好结果，在日本进行的“试点”临床试验中HF10首次在人体中进行测试。这些I期临床研究主要针对转移性乳腺癌(n = 6)、复发性头颈部癌(n = 2)和胰腺癌(n = 6)。与临床剂量的T-Vec ,G207和G47Δ相比使用相对较低的剂量，没有观察到严重的不良反应，报道了一些治疗前景。研究人员还报道了HF10对复发性乳腺癌患者肿瘤微环境的影响。

随后在日本或美国进行了几项HF10的临床试验，均由Takara Bio Inc.赞助。从2009年开始，在美国开展了一项针对难治性头颈部肿瘤或伴有皮肤和/或表面病变的实体肿瘤的I期研究(NCT01017185)。结果表明，HF10治疗耐受性良好，无3级或更严重的药物不良反应。研究人员还报告说，在24例可评估反应的患者中，有8例(33%)有稳定的疾病(SD)。2012年，Mie大学开展了肿瘤内注射HF10治疗难治性实体瘤的一期研究，但该研究最终终止(UMIN000007263)。名古屋大学于2013年开始对晚期不可切除胰腺癌患者进行肿瘤内使用HF10的I期研究。本研究在内镜超声引导下，1x106、3x106或1x107 HF10 PFU联合常规化疗(吉西他滨+厄洛替尼)给药4次。10例接受治疗的患者中，未发现与HF10相关的严重不良事件，6例患者报告化疗引起的骨髓抑制分级，2例患者报告与HF10无关的严重不良事件。除终止者外，总体反应为:部分反应(PR) 3例，SD 4例，进展性疾病(PD) 2例。

2014年，美国开始对无法切除或转移性黑色素瘤患者进行HF10和抗CLTA -4免疫检查点抑制剂ipilimumab联合治疗的II期研究(NCT02272855)。其最终结果在2017年美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上公布：在46名登记的患者中，37%有3级不良事件，其中大多数是由于ipilimumab;hf10相关的3级不良事件(n = 3)包括栓塞、淋巴水肿、腹泻、低血糖和腹股沟疼痛。根据免疫相关反应标准(irRC)，24周(主要终点)的最佳总体反应率为40.9%(完全反应18.2% [CR]和22.7% PR)，疾病稳定率(CR + PR + SD)为68.2% (27.3% SD)。2015年，日本国家癌症中心医院(NCT02428036)启动了HF10在实体瘤合并浅表病变患者中的一期研究。6例患者中3例发生HF10相关不良事件，均为1级，无剂量限制毒性报道。研究人员得出结论，与之前在美国进行的一期试验(NCT01017185)相比，HF10的安全性没有显著差异(67)。目前日本正在进行一项HF10联合ipilimumab治疗无法切除或转移性黑色素瘤的多中心II期研究(NCT03153085);本试验符合上述在美国完成的第二期试验(NCT02272855)。

目前正在计划另外两项HF10的试验:一项是在美国进行的针对nivolumab的II期新辅助试验，nivolumab是一种抗pd -1免疫检查点抑制剂，与HF10联合用于治疗可切除的IIIB、IIIC或IVM1a黑色素瘤(NCT03259425);另一项是HF10联合化疗(吉西他滨+钠-紫杉醇)治疗日本病人不可切除胰腺癌(NCT03252808)的I期研究。据估计，前者的报名人数为20人，后者为6人，不过这两家机构都还没有开放招募。

腺病毒是一种非包膜双链DNA病毒，是基因治疗中最常用的载体之一。它们在溶瘤病毒治疗中的应用也得到了广泛的研究。例如，第一个在临床试验中被测试的溶瘤病毒是ONYX-015，这是一种工程腺病毒，含有缺失的E1B -55 kDa基因，这允许它只能在p53突变的细胞中复制。与基于HSV- 1的治疗策略一样，基于腺病毒的溶瘤病毒治疗现在是这类治疗的主流。在日本，两种溶瘤腺病毒已在临床试验中得到测试。

Telomelysin®,也称为OBP-301,是一个端粒酶特异性, 在人类端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制下驱动腺病毒E1A 、E1B基因，具有复制能力的溶瘤腺病毒。它导至人类癌症肿瘤特异性复制，在人类癌细胞内裂解，通过抑制辐射诱导的DNA损伤修复作为辐射敏化剂。超过30个临床研究报道了Telomelysin®对各种恶性肿瘤,包括肺癌,食道癌,结肠直肠癌,胃癌,支气管肺泡癌,肝癌,头颈癌,前列腺癌,肾细胞癌,卵巢癌,恶性胸膜间皮瘤,腺样囊性癌,骨肉瘤, 软组织瘤，胃干细胞癌的抗肿瘤疗效。

一项在美国进行的I期临床试验来确定Telomelysin®在晚期实体瘤患者内的安全性。在这项研究中, 单一的Telomelysin® (1×10 10 1×10 11或1×1012 病毒颗粒) 被注射到16个病人的各种实体肿瘤内。该治疗在所有剂量水平均耐受良好，常见的1级和毒副反应包括注射部位反应、疼痛、硬化和全身反应(发热、发冷)。12例患者中有9例活检显示hTERT表达。1例患者达到PR, 7例患者为SD，提示Telomelysin®具有抗肿瘤活性。

基于这些发现，Okayama大学正在进行Telomelysin®联合放疗治疗食管癌的I/II期研究 (UMIN000010158)。不符合标准治疗条件的食管癌患者被纳入研究中; 于第1、18和32天时进行Telomelysin®(1×1010 1×1011或1×10 12个病毒颗粒)瘤内给药，并同时给予6周以上的电离辐射，从第4天开始，剂量总达60Gy。到目前为止，已有10名患者接受了治疗，其中一名中途退出。其余9名患者均出现短暂的自限性淋巴增多症;其中2例为淋巴细胞减少症，放疗中断可恢复淋巴细胞减少症。7例患者达到CR，即在活检标本中未发现活的恶性细胞。另2例患者，1例内镜下肿瘤消退，1例SD。该项临床试验仍在进行中，目前Oncolys BioPharma Inc正在计划开展另一项设置与方案相似的I期临床研究(NCT03213054)。

除上述试验外，目前台湾和韩国的肝癌患者正在进行肿瘤内Telomelysin®I/II期临床试验(NCT02293850)。另一项II期研究也在美国进行，目的是评估Telomelysin®对不可切除的III期和IV期黑色素瘤患者的疗效、安全性和免疫反应(NCT03190824)。此外，日本东部国家癌症中心医院正在计划进行Telomelysin®联合pembrolizumab治疗晚期实体肿瘤患者的I期研究(NCT03172819;UMIN000026961)。

另一种溶瘤腺病毒被开发出来随后在Kagoshima大学进行了临床试验。研究人员已经研究了条件复制腺病毒(CRAs)，这种病毒以多种因子为靶点攻击肿瘤细胞，称为m-CRAs，以提高肿瘤特异性和抗肿瘤疗效。在已经开发的几个m-CRAs中，Surv.m-CRA是一种对生存反应灵敏的m-CRA，表现出最大的潜力;它超越了Tert.m-CRA。是一种TERT反应性的m-CRA，具有肿瘤特异性和细胞毒活。研究人员已经报道了Surv.m-CRA对于对传统治疗方法有耐药性的干细胞癌症是有效的，而且这种病毒可能通过消除再生医学中未分化的细胞来预防多能干细胞引发的畸胎瘤。

基于这些临床前研究，2016年Kagoshima大学(UMIN000023120)进行了一项Surv.m-CRA针对晚期实体肿瘤患者的一期临床研究。研究人员最近报告说，第一个病人接受了Surv.m-CRA最大剂量的1/100，就表现出安全性和一定的有效性，尽管研究仍在进行中。

仙台病毒，又称日本血凝病毒(HVJ)，是副粘病毒科的一员。它是一种小鼠副流感病毒，即非人类病原体，由一个由核蛋白包裹的非分段，线性负链RNA基因组组成。紫外线照射仙台病毒被称为仙台病毒颗粒、HVJ -包膜(HVJ-E)、GEN0101和TSD-0014，都被开发为基因治疗和药物传递的有效载体。虽然仙台病毒颗粒缺乏病毒复制能力，但据报道，它可以诱导癌细胞死亡和刺激抗肿瘤免疫。因此，尽管使用复制缺陷病毒进行溶瘤病毒治疗是不寻常的，仙台病毒颗粒已经被开发用于治疗。

不管在体外还是体内，人去势性前列腺癌中，仙台病毒粒子通过产生干扰素(IFN)-α和 IFN-β诱导细胞凋亡，直接杀伤肿瘤细胞;在体内它还通过激活自然杀伤细胞诱导抗肿瘤免疫，抑制调节性T细胞激活T细胞毒性。在结肠癌和肾癌异种移植中，仙台病毒颗粒诱导树突状细胞分泌I型IFN和IL-6，通过激活细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞消灭小鼠肿瘤细胞。仙台病毒颗粒激活的树突状细胞也通过IL-6抑制调节性T细胞。

基于这些临床前研究结果，2011年至2014年大阪大学(Osaka University)开展了一项I/II期仙台病毒颗粒瘤内及皮下注射治疗去势性前列腺癌患者的试验 (UMIN000006142)。采用3+3剂量递增设计，仙台病毒颗粒(低剂量3000神经氨酸酶检测单位 [mNAU]或高剂量10000 mNAU)于第1天直接注射至前列腺，5、8、12天皮下连续注射2次，疗程28天。七名患者被纳入研究，其中六人接受了治疗。2级或3级不良事件为尿潴留和淋巴减少，患者自行痊愈;无不良事件发生。低剂量组3例为SD，高剂量组1例为SD, 2例为PD。低剂量组治疗2周后，1例患者前列腺特异性抗原(PSA)从14 ng/ml下降至1.9 ng/ml, PSA应答率为16.6%。研究人员得出结论，仙台病毒粒子瘤内和皮下注射耐受性好且可行，并且在一组前列腺癌患者中观察到PSA反应。随后2015年大阪大学开始了使用更高剂量仙台病毒颗粒(30,000和60,000 mNAU)的I期试验，目前正在进行中（UMIN000017092）。

大阪大学(Osaka University)自2009年开始进行另一项关于仙台病毒颗粒在恶性黑色素瘤患者瘤内给药的I/IIa期研究(UMIN 000002376)。仙台病毒颗粒(低剂量3000mNAU或高剂量10000 mNAU)用于IIIC期或IV期恶性黑色素瘤患者的瘤内注射。此外，2015年大阪大学(Osaka University)启动了仙台病毒颗粒在化疗耐药恶性胸膜间皮瘤患者体内和皮下注射的I期研究(UMIN 000019345)，目前正在进行中。本试验中，仙台病毒颗粒(低剂量30000mNAU或高剂量60000mNAU)每2周给药4次，然后冲洗2周，重复此循环2次。

迄今为止，溶瘤病毒治疗的巨大潜力不仅在于其直接杀伤细胞活性，而且可能增强宿主的抗肿瘤免疫。为了进一步验证后一种效果，已经进行了几项研究来评估溶瘤病毒治疗和免疫调节结合的效果，特别是与免疫检查点抑制剂的结合。值得注意的是，最近发表了一项关于T-VEC与ipilimumab联合治疗IIIb–IV期黑色素瘤的Ib期临床试验结果(NCT01740297)。19例患者被纳入安全性分析，无剂量限制毒性反应发生。26.3%的患者出现3/4级治疗相关不良事件;其中15.8%可归因于T-VEC, 21.1%可归因于ipilimumab。此外，联合治疗比单一治疗更有效。客观有效率为50%，44%患者有持续≥6个月的耐受性;中位随访时间为20个月，18个月无进展生存率为50%，18个月总生存率为67%。此外，目前正在进行多项评估T-VEC和免疫检查点抑制剂联合应用的临床试验，并等待其结果:在未切除的黑色素瘤中，进行了T-VEC和pembrolizumab联合应用与单独使用pembrolizumab疗效比较的Ib/III期研究(NCT02263508);T-VEC联合pembrolizumab治疗转移性头颈部癌的I期研究(NCT02626000 [MASTERKEY232]);T-VEC联合pembrolizumab治疗晚期肉瘤的II期研究(NCT03069378)。在日本,两个由溶瘤病毒与免疫抑制剂检查点结合的治疗方案正在进行或计划中，如表1中所描述: HF10结合ipilimumab治疗黑色素瘤的II期临床试验 (NCT03153085)和Telomelysin结合pembrolizumab治疗严重实体瘤的I期临床试验 (NCT03172819;UMIN000026961)。

另一种增强溶瘤病毒治疗免疫调节作用的方法是通过插入转基因(s)来“武装”病毒，其中最具代表性的是T-VEC的GM-CSF表达。例如,G47Δ,第三代溶瘤细胞的1型单纯疱疹病毒,已经利用细菌人工染色体(BAC)技术携带了几个转基因。这种利用BAC和两个重组酶系统(Cre / loxP和Flp / FRT)的方法由Fukuhara等人建立，她可以快速、可靠、同时构建多个G47Δ-为基础的溶瘤细胞1型单纯疱疹病毒,可以表达插入的转基因。到目前为止，插入的转基因包括:IL-12、IL-18、可溶性B7.1、血管抑制素、血小板因子4、显性阴性成纤维细胞生长因子受体和血小板反应蛋白-1。临床前研究表明这些转基因(如IL-12)的临床应用前景， 一个新的“武装”G47Δ在不久的将来可能会被应用到日本病人身上。

有了这些以免疫学为导向的方法，溶瘤病毒疗法将在日本的临床试验中得到越来越多的研究，并有可能最终成为癌症的标准化治疗选择。

溶瘤病毒治疗是一种新的抗癌策略，已经开发了几种不同的亲本病毒，包括HSV-1，腺病毒和仙台病毒。目前在日本基于这种方法的许多临床试验已经进行或正在进行中。这些试验的结果表明溶瘤病毒治疗可能在不久的将来成为癌症的一个重要和主要的治疗选择。