搞不懂细胞周期实验？用这个盘它！

幸福侠侣

细胞周期是细胞内一种隐藏时钟，精心安排着细胞的一生——生长与分裂周期。
细胞周期作为细胞内外信号交互作用的精密调控过程，其驱动运转的引擎就是以CDKs和Cyclins为核心的细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶。



在细胞周期的不同时期，不同的Cyclin-CDK复合物驱动着细胞周期的运转。



然而，细胞一旦跳出此轮回，必然会处于增殖失控的状态，给机体造成不可避免地伤害，肿瘤细胞便是如此。
那么为了避免细胞无限制增殖，细胞周期中必然也存在着刹车系统。而CDKs抑制蛋白（CDKIs）就对细胞周期起着抑制的作用。



细胞周期的完成，最直观的结果，就是细胞一分为二。为了保证细胞分裂的忠实性，细胞设置了一系列关卡，就是所谓的细胞周期检查点（check point）。



通常在研究某个基因表达或者药物对细胞周期的影响，要么检测相关明星分子（如Cyclin、CDK、CKI以及Rb通路和p53通路的明星核心分子）；



要么进行PI（碘化丙啶）染色实验，PI是一种插入性核酸荧光染料，能选择性地嵌入核酸DNA双链螺旋的碱基之间并发出荧光。
至于后者，因PI结合的量与DNA的含量成正比例关系，可通过流式细胞仪来了解细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个细胞周期时相的百分含量，了解细胞的增殖能力。
在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。



实验步骤

1）细胞培养与收集
1、将对数期的细胞接种于6孔板中（2×105个/孔，根据细胞大小、增殖速度适当调整），每孔加2 ml培养基培养，分别加入培养基配置的不同浓度药物1 ml孵育。
2、药物作用结束后，悬浮细胞直接离心（1500 rpm，4 min）收集细胞，用预冷PBS洗细胞2-3次；
而贴壁细胞，用胰酶消化后，轻柔吹打细胞，避免细胞受损、细胞黏连；离心弃上清（1500 rpm，4 min），用预冷PBS洗细胞2-3次，以去除培养基、药物残留及细胞碎片。
3、细胞沉淀中加入少量 PBS，轻柔充分重悬细胞。然后将重悬的细胞加入到 4℃预冷的 70％冰乙醇中固定，轻轻吹打均匀（切记！！！不要将冰乙醇加入到细胞中，这样会造成细胞黏连，严重影响结果），封口膜封口，4℃过夜。
2）细胞染色与检测
1、从冰箱中拿出细胞，2000 rpm 离心 4 min，去上清液，PBS 洗两次，去上清液。2、100ul 100ug/ml RNase A和0.2% Triton X-100重悬细胞，37℃水浴中30 min3、加入400ul 50ug/ml PI，涡旋振荡混匀，室温避光孵育 30 min。4、流式细胞仪检测细胞周期，一般计数10万个细胞，在激发波长488nm波长处检测红色荧光，而后用FlowJo 软件分析细胞周期时相分布，分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除粘连在一起的细胞。
上机检测时，必须重悬成细胞悬液再检测，否则容易堵仪器管道；如果细胞过多或聚团严重，可先用300目（孔径40-50um）尼龙网过滤，再上机检测。

实验数据分析

常用的流式检测法分析细胞周期的方法是根据横坐标的细胞DNA含量结合纵坐标的有效细胞数量来分析的，如以下细胞周期分布图：


图形区（左侧）
G0/G1期：流式检测结果图的第一个峰；G1期是DNA含量最少的时期，DNA复制还没有开始；G0期是细胞静止期，不复制DNA，无法与G1期分开；
而左侧第一个峰的左侧的一片区域则为sub-G1期，该期的细胞都是发生凋亡的细胞，和细胞周期没有关系。
S期：在流式结果图中显示为第二个不高但很宽的峰；此时期细胞开始复制到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程；
G2/M期：流式检测结果图的第三个峰。G2期是DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA；M期是细胞分裂的过程，此时细胞内是二倍DNA，无法与G2期分开。

数据分析区（右侧红方框）
各时期比值：Dip G1-73.32% at 49.57表示G1期DNA含量平均值为49.57（2N），占细胞总数的73.32%。
同理，Dip G2-9.58% at 99.15则表示G2期DNA含量平均值为99.15（4N），占细胞总数的9.58%。
以此类推，可以得知S期和G2/G1期的百分比；
CV：表示峰的变异系数，其分辨率由G0/G1峰的CV来反映。一般CV越小，峰形越好，越尖锐；能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就被认可了。
这个指数在DNA检测中很重要，因为不同物种之间细微的DNA差别都有很重要的意义。而影响CV的因素主要包括样品制备染色过程的人为影响和仪器，所以建议同一个实验尽量由一个人在同一台机器上完成。
Debris：表示细胞碎片，越少越好；
其他：Aggregates：表示细胞聚集体;Modeled events：表示仪器检测到的总细胞数；All cycle events：表示在细胞周期中分析的细胞数（即排除了细胞碎片和聚集体）
细胞周期的检测常用于研究药物或者基因等对细胞周期阻滞的影响，以药物处理MDA-MB231细胞后的周期分布图为例，通过比较Control组和药物组，发现药物处理组的G2/M期峰值变高，即G2/M期细胞数量增多，即药将其阻滞在G2/M期。


注：对于未处理的细胞一般都是分裂间期时间比分裂期长，即G1-S期＞M期。

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