流式细胞术的仪器有哪些？

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流式细胞术的仪器有哪些？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/503091067

队长是我

第1阶段：样品制备
首先，我们收获细胞或组织并制备单细胞悬浮液。然后，我们将根据所使用的细胞数量和体积，将单细胞悬浮液转移到96孔板、试管或聚苯乙烯圆底管中。

所需材料：
-细胞悬液
-聚苯乙烯圆底12×75 mm2法尔肯试管/96孔板(或与您的离心机兼容的任何 容器)
-悬浮液/洗涤缓冲液(PBS、5-10%胎儿细胞血清(FCS))
-可选–红细胞裂解缓冲液(例如，R377982)

步骤
所需时间约20分钟
1 根据指导收获和洗涤细胞。
     1.1 对于血液样本，我们建议将样本与红细胞裂解缓冲液(例如R377982)一起 孵育。
提示1：红细胞裂解缓冲液会裂解红细胞，这可能会干扰白细胞(有核细 胞)的分析。
提示2：通过避免气泡、剧烈涡旋、缓冲液更换期间吸出整个溶液以及 过度离心来 防止细胞损伤。

2 确定细胞总数并检查细胞活力。
2.1 一般来说，存活率应为90-95%。

3 离心并在冰冷的悬浮缓冲液中重悬细胞样品。
3.1 在4°C下以约200g离心5分钟，
3.2 推荐的悬浮细胞浓度：0.5–1×106个细胞/mL。
提示：旋转时间和速度可能需要优化。一般来说，应充分离心细胞以便 去除上清液，但为了不会造成细胞损失，离心力不要太强，以免细胞难 以重悬。
  警告： 较高细胞浓度可能会堵塞流式细胞仪系统并影响分辨率。

4 继续用活性染料染色。

第2阶段：使用活性染料进行活细胞/死细胞染色
由于死细胞容易与抗体发生非特异性结合，因此我们必须将这些细胞排除在分析之外。使用活性染料使我们能够区分活细胞和死细胞，并在数据采集和分析过程中排除死细胞。
DNA结合染料(例如7-AAD、DAPI和TOPRO3)通常用作活细胞/死细胞染色的活性染料，因为它们无法穿透活细胞的细胞膜。死细胞中受损的细胞膜使这些染料能够接触DNA，与DNA结合并发出荧光。
然而，这些染料不能用于固定细胞的活/死染色，否则所有细胞的细胞膜都会受到损害。在这种情况下，我们必须使用胺反应性可固定细胞活力染料。

所需材料:
-活性染料
-不可固色染料的示例：7-AAD、DRAQ-5(D266292)、DRAQ-7(D266297), 或 DAPI (D598342)
-可固色染料
-悬浮液/洗涤缓冲液(例如：PBS、5-10% 胎儿细胞血清(FCS))

步骤
1 用活性染料对细胞进行染色。
1.1 根据制造商的说明，在4°C的黑暗中用染料孵育细胞。
警告：将荧光团保存在黑暗中以避免光漂白。
提示： 选择发射光谱不与免疫染色所用荧光团重叠的染料。

2 用洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
  2.1 将细胞向下旋转(200g，5分钟，4°C)，去除上清液，并在每次洗涤 后重新悬浮沉淀。
  提示：洗涤步骤数、旋转时间和速度可能需要优化。当使用过量的 洗涤缓冲液并在离心后去除尽可能多的液体时，一次洗涤步骤可能 就足够了。

3 当检测细胞外靶标时继续封闭，或者对细胞内靶标进行固定和透化。

第3阶段：固定和透化(仅适用于细胞内染色)
当对细胞内靶标进行染色时，我们必须进行额外的固定和透化步骤。需要固定保留细胞内蛋白质的结构。透化作用会破坏细胞膜，使抗体进入细胞并对细胞内靶标进行染色。
当对细胞外靶标进行染色时，我们将立即进行封闭步骤。当一起分析细胞内和细胞外靶标时，我们需要在固定和透化之前进行细胞表面染色（参见第5阶段）。

选择合适的细胞内染色固定和透化方法的有用提示：
-靠近质膜的抗原和可溶性细胞质抗原需要轻度细胞透化，无需固定。
-细胞骨架、病毒和一些酶抗原当用高浓度的丙酮、酒精或甲醛固定时，通常会产生最佳结果。
-细胞质细胞器和颗粒中的抗原是否需要固定和透化方法，具体取决于抗原。
-表位需要保持可接近性。

所需材料：
-细胞悬液
-悬浮缓冲液(PBS、5-10% FCS)
-固定剂(例如1-4%多聚甲醛、90%甲醇或丙酮)
-透化溶液(例如Triton X-100、NP-40或皂苷)
-或者您可以使用流式细胞术固定和透化试剂盒，适用于大多数样本类型。

步骤
所需时间约1小时15分钟
1 用您选择的固定剂固定细胞。
1.1 将细胞离心成沉淀（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，并将沉淀重悬 于固定剂中。
1.2 如下所示用固定剂孵育细胞。
  提示：固定需要针对不同抗原进行优化。 有些表位对甲醇非常敏感，因 此如果检测出现任何问题，请尝试使用丙酮。

固定剂	时间
1-4%多聚甲醛 (PFA)	冰上15-20分钟
90%甲醇	–20°C 10分钟
100%丙酮*	冰上10-15分钟
*聚苯乙烯/塑料管不适合与丙酮一起使用。

2 用悬浮缓冲液洗涤细胞两次。
  2.1 将细胞离心（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，并重悬于洗涤缓冲液中。
  提示：洗涤步骤数、旋转时间和速度可以进行优化。当使用过量的洗涤 缓冲液并在离心后去除尽可能多的液体时，一次洗涤步骤可能就足够了。

3 通过用合适的去污剂孵育细胞来透化细胞。
  3.1 将细胞离心成沉淀(200g，5分钟，4°C)，弃去上清液，并重新悬浮在洗涤剂溶液中。
  3.2 将细胞在去污剂中室温孵育10-15分钟。
  3.3 注意：如果使用丙酮作为固定剂，则不需要此步骤，因为丙酮也可以透化细胞。

洗涤剂	建议浓度
刺激性/强效清洁剂：Triton X-100、NP-40	PBS中0.1–1%
温和清洁剂：Tween 20、皂苷、毛地黄皂苷、leucoperm	PBS中0.2–0.5%

提示1：最佳去垢剂的选择取决于蛋白质及其定位。Triton或NP-40等强 效去污剂会部分溶解核膜，因此适合核抗原染色。相比之下，温和的去 污剂，如Tween 20或皂苷，使抗体能够穿过孔而不溶解质膜，这使得它 们适合细胞质或质膜细胞质面的抗原和可溶性核抗原。
提示2：应根据您的样品优化去污剂的浓度。提示3：透化会影响细胞在 流式细胞仪上的光散射谱；在检测和数据分析(第6阶段)期间对细胞群 进行门控时，请记住这一点。

4 用悬浮缓冲液洗涤细胞两次。
  4.1 将细胞离心（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，并重新悬浮在洗涤缓 冲液中。
  提示：洗涤步骤数、旋转时间和速度可能需要优化。当使用过量的洗涤 缓冲液并在离心后去除尽可能多的液体时，一次洗涤步骤可能就足够。  

5 进行后续阻断步骤。

第4阶段：阻断
阻断蛋白质和Fc结构域对于防止抗体与细胞非特异性结合至关重要。

所需材料：
材料的选择取决于被分析的细胞类型以及所使用的二抗(如果适用)
FcR封闭缓冲液(例如，2-10%山羊血清、人IgG或小鼠抗CD16/CD32)
悬浮缓冲液(PBS、5-10% FCS)

步骤
所需时间约45分钟
1 用封闭缓冲液封闭Fc受体。
  1.1 将细胞离心成沉淀(200g，5分钟，4°C)，弃去上清液，并重悬于封闭缓 冲液中。
  1.2 将细胞与缓冲液在黑暗中于4°C孵育30-60分钟。

2 用洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
  2.1 将细胞向下旋转(200g，5分钟，4°C)，去除上清液，并在每次洗涤后重 新悬浮沉淀。
          提示：洗涤步骤数、旋转时间和速度可能需要优化。当使用过量的洗涤 缓冲液并在离心后去除尽可能多的液体时，一次洗涤步骤可能就足够 了。  

3 继续进行抗体孵育。

第5阶段：抗体孵化
我们现在准备用荧光团偶联的抗体对细胞进行染色，以便在流式细胞仪中进行间接或直接检测。
以下程序也可以重复并适用于多色流式细胞术，其中针对不同靶标使用多组荧光团缀合抗体。当使用多组抗体时，我们应该尽量减少荧光团发射光谱的重叠。

直接抗体标记
所需材料：
-缀合一抗
-样品(0.5-1×106细胞/mL的细胞悬浮液)
-悬浮缓冲液(PBS、5-10% FCS)




步骤
时间约40分钟
1 在悬浮缓冲液中稀释结合的一抗。
   1.1 数据表上通常会提供每种抗体的建议稀释度。
提示： 通过连续稀释来滴定抗体将有助于找到最适合您的实验的抗体浓度。

2 在预稀释的一抗中孵育细胞。
  2.1 将细胞离心(200 g，5分钟，4°C)，弃去上清液，并将细胞重悬于一抗溶 液中。
  2.2 4°C避光孵育20-30分钟。固定细胞可以在室温或4°C下孵育。
  提示：此步骤可能需要优化。
  警告：将荧光团保存在黑暗中以避免光漂白。

3 用悬浮缓冲液洗涤细胞两次。
  3.1 将细胞离心(200g，5分钟，4°C)，去除上清液，并在每次洗涤后重新悬 浮。
  3.2 提示： 洗涤步骤数、旋转时间和速度可能需要优化。当使用过量的洗涤 缓冲液并在离心后去除尽可能多的液体时，一次洗涤步骤可能就足够。

4 尽快进行流式细胞仪检测。
4.1 如果抗体染色后(1小时内)未立即在流式细胞仪中分析细胞且未提前固 定，则可在此步骤固定染色细胞(1-4% PFA，4°C ,20分钟)。固定有助于 将细胞保存数天，稳定光散射并灭活大多数生物危害剂。控件需要使用 相同的程序进行固定。 请注意，固定会杀死细胞，并且与不可固定的细 胞活力染料不兼容(如果之前使用过这些染料)。
        提示：孵育后立即获得最佳结果。
        警告： 如果您打算实时研究细胞，请勿修复细胞。
  4.2 固定后洗涤细胞3次，并将细胞悬液储存在悬浮缓冲液中。
  4.3 请遵循使用说明。
   提示： 将细胞保存在黑暗的冰上或4°C的冰箱中，直到您安排的分析时间。

间接抗体标记
间接标记需要两个孵育步骤，首先使用一抗，然后使用兼容的二抗。二抗（而非一抗）结合有荧光染料（FITC、PE、Cy5®等）。
所需材料：
-一抗
-偶联二抗
-样品（0.5 – 1×106 细胞/mL 的细胞悬浮液）
-悬浮液/洗涤缓冲液（PBS，5-10% FCS）




步骤
时间约1小时15分钟
1 在悬浮缓冲液中稀释一抗和二抗。
1.1 抗体数据表上通常会提供每种应用的建议稀释度。
   提示：通过连续稀释来滴定抗体将有助于找到最适合您的实验的抗体浓度。

2 在预稀释的一抗中孵育细胞。
2.1 将细胞离心(200g，5分钟，4°C)，弃去上清液，并重悬于一抗溶液中。
2.2 4°C避光孵育20-30分钟。固定细胞可以在室温或4°C下孵育。
提示：可能需要优化孵育时间。

3 用悬浮缓冲液洗涤细胞两次。
3.1 每次洗涤后将细胞向下旋转(200g，5分钟，4°C)，除去上清液并重新悬 浮沉淀。
3.2 提示：洗涤步骤数、旋转时间和速度可能需要优化。当使用过量的洗涤 缓冲液并在离心后去除尽可能多的液体时，一次洗涤步骤可能就足够了。

4 在预稀释的二抗中孵育细胞。
4.1 将细胞离心(200g，5分钟，4°C)，弃去上清液，并将沉淀重悬于 二抗溶 液中。
4.2 在黑暗中孵育20-30分钟 将荧光团保持在黑暗中以避免光漂白非常重要。

5 用洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
5.1 将细胞离心成沉淀(500g，5分钟，4°C)，弃去上清液，并重悬于洗涤缓 冲液中。
5.2 提示：洗涤步骤数、旋转时间和速度可能需要优化。当使用过量的洗涤 缓冲液并在离心后去除尽可能多的液体时，一次洗涤步骤可能就足够。

6 尽快进行流式细胞仪检测。
6.1 如果抗体染色后(1小时内)未立即在流式细胞仪中分析细胞且未提前固 定，则可在此步骤固定染色细胞(1-4% PFA，4°C, 20分钟)。固定有助于 将细胞保存数天，稳定光散射并灭活大多数生物危害剂。控件需要使用 相同的程序进行固定。 请注意，固定会杀死细胞，并且与不可固定的细 胞活力染料(如果之前使用过)不兼容。
  提示：孵化后立即获得最佳结果。
  警告：如果您打算实时研究细胞，请勿修复细胞。
6.2 固定后洗涤细胞3次，并将细胞悬液储存在悬浮缓冲液中。
6.3 按照使用说明进行数据采集。
  提示： 将细胞保存在黑暗的冰上或4°C的冰箱中，直到您安排的分析时间。

第6阶段：检测和数据分析
抗体孵育后，我们可以在流式细胞仪中运行我们的实验。该程序很大程度上取决于所使用的设备，因此请务必首先咨询制造商。




当表面染色的细胞是活细胞且未固定或透化时，可以使用荧光激活细胞分选 (FACS) 将其分离。利用 FACS，可以根据活细胞的特性将其分为不同的群体。然后我们可以对分离的细胞进行下游分析。




如需了解更多信息，请访问我们的官网，旨在帮助您从细胞中获得最佳数据。Flow cytometry protocol
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同花顺

流式细胞仪通常配有多个激光器，它们产生特定波长的光。由于每种荧光染料发出的光通常结合长通或短通滤光片被带通滤光片过滤，故流式细胞仪只检测特定波长范围内的荧光。在选择荧光染料时，请确认仪器带有能够激发目标荧光染料的激光器，以及能够检测该染料发射光的滤光片组合。抗体选择/多色组合设计
一般来说，在同一样品上使用的荧光染料越多，从该样品中收集到的信息也越多。在单个样品上组合使用多种荧光染料时，设计需要遵循以下几点基本建议：

<10种颜色1.抗原密度*应该与荧光染料亮度相匹配
◆最重要的是，低密度或难以检测的标志物应该与明亮的荧光染料配对。
◆高密度的标志物与中等或暗淡的荧光染料配对。
2.选择跨通道的荧光染料，最大限度减少荧光溢漏。
3.测试！

>10种颜色1.让低表达丰度的标志物与明亮的荧光染料相匹配。
2.最大限度减少溢漏，特别是低表达抗原。
3.利用溢漏扩散矩阵(SSM)**来确定哪些通道的分辨率可能受到影响。
4.对于相互排斥的抗原(同一类细胞上不会同时表达的抗原),将次优的荧光染料组合留给它们。
5.测试！

*什么是抗原密度？抗原密度指的是蛋白质在细胞内或细胞上的表达水平(详见下图)，这是在多色设计时的一个重要考虑因素。为了确保能被检测到，低水平表达的抗原、细胞内抗原或连续表达（非诱导）的抗原应当与最明亮的荧光染料配对。抗原密度和预期表达模式可在网上或文献中查到。








**溢漏与溢漏扩散之间有何差异？溢漏是指荧光染料的信号“溢出”到其他的检测器。这是由荧光染料发射和仪器光学设置产生的问题。如下图所示，绿色信号（AF488）除在FITC滤光片（515-545nm）中检测到。也在邻近的PE滤光片（564-606nm）中检测到。这种溢漏可通过补偿来校正。




溢漏扩散是因多个荧光染料溢出到每个检测器而导致的测量误差，这引起某些通道的分辨率降低。

1随着实验中荧光染料的数量不断增加，溢漏扩散变得影响更大，并且荧光越亮，扩散越大。通过建立溢漏扩散矩阵（SSM）可识别哪些通道可能出现溢漏扩散的问题。一般来说应避免暗淡信号受到这种现象的影响。
在下图的例子中，2号检测器的荧光扩散到1号检测器，随着2号检测器的信号增强，扩散也增大。因此，如果要分析1号检测器中的低表达抗原（浅灰色圆圈）和2号检测器中的高表达抗原（橙色），低表达抗原的检测会受到影响。



实验对照
流式细胞术的对照可分为五大类2：

仪器对照仪器对照是通过追踪激光器、检测器和流体性能，从而确认仪器是否正常工作3。一般来说，这些对照涉及到仪器制造商提供或出售的校准颗粒或荧光微球。这些质量控制微球应在仪器运行的每一天使用。

补偿对照当荧光染料之间的发射光谱重叠时，这些信号会扩散到多个通道。校正溢漏的过程被称为补偿4。补偿可确保检测器只计算该通道特定的荧光发射光（图1）。补偿实验需要每种荧光染料的单染样品（每个样品只染一种染料）。这些可以利用细胞、补偿微球或抗体捕获微球*来设置。在创建补偿对照时，请注意四个基本原则：





图1.未补偿vs.补偿的数据。利用CD3/CD28抗体刺激人CD3+T细胞7天。利用hCD4A700抗体（R&DSystems货号FAB3791N）和hCD25APC抗体（R&DSystems货号FAB1020A）对细胞进行染色。图中显示了未补偿（a）和补偿（b）的hCD4和hCD25的散点图。

①补偿荧光染料必须与实验荧光染料完全匹配。
◆同一通道内的荧光染料仍具有不同的发射光谱，并且不可互换。例如，FITC不能作为GFP的补偿对照。
◆由于复合染料的差异，实验中的复合染料标记抗体应当与补偿计算所用的抗体完全相同（来自同一支抗体）。使用相同的复合荧光染料偶联不同的抗体、甚至仅是不同批次抗体，都可能会导致计算结果不准确。
②补对照的亮度必须与实验样品相同或更高。
③对于任何对照，阴性和阳性群体的自发荧光必须相同。最好的做法是单独为每个通道的阳性和阴性群设门，避免使用通用的阴性对照。
④收集足够多的事件！补偿依赖于荧光强度中位值的准确计算，如果事件太少，将无法准确计算。收集数量应多于5000个。

*抗体捕获微球与抗体重链结合,因此与生物样品不同,不需要特异性抗原识别。作为实用性补偿试剂,这些微球可提高补偿的一致性,特别适用于:
●阳性群体染色暗淡或稀少。补偿微球具有强烈的荧光信号，使得补偿对照的亮度与实 验样品相同或更高
●处理多种荧光染料
●样品数量有限

设门对照在分析流式细胞术的数据时，最关键的是正确设门。当细胞群体无法清晰界定或比较稀少时，需要荧光减一对照（FluorescenceMinus One，FMO）来解释流式数据并准确设门。FMO对照能够在多色实验中可靠评估背景，故它们能准确区分阴性和阳性细胞群体。

制备FMO对照是用所有荧光抗体染色细胞，但去掉某一种荧光抗体。例如，如果利用AF488、PE、APC和DAPI开展四色实验，那么FMO对照可按照下表来设置：






特异性染色体对照抗体与细胞结合有三种基本形式：
a.Fab区域与抗原结合（理想情况）
b.Fc区域与Fc受体结合（通常不想要）
c.非特异性结合（脱靶抗原、“粘”住细胞膜等）

在各种流式细胞术分析中，避免非特异性结合的最佳方法有:
a.正确滴定所有的试剂
b.封闭细胞的Fc受体
c.加入一种细胞活性染料以排除死细胞






▶ 什么是同型对照？
同型对照可用于评估因抗体类别引起的非特异性结合。同型对照是指与一抗的类别、亚型和荧光标记物一致但对目标靶点无特异性结合的抗体。通过检测背景染色，同型对照可以指示实验步骤是否需要进一步优化。同型对照可用于确定：

◆细胞是否充分封闭：如果未完全封闭，同型对照将与Fc受体结合。如果非特异性结合的原因在于细胞存在“粘性”，特别是死细胞的存在，则可在染色液中加入DNA酶。

◆胞内指标染色期间是否充分洗涤：针对细胞内靶标的抗体即使不与抗原结合，也常常会出现被拦在细胞内。
同型对照一直是流式细胞术中最常用的阴性对照之一。但是，完全匹配的同型对照必须与待测抗体有着相同的免疫球蛋白重链和轻链，而且荧光染料与抗体的偶联比例也相同。在同型对照不满足这些要求的情况下，用户必须小心背景染色的过度解读2,5。对于多色流式组合，同型对照无法解释其他通道中的试剂所引起的背景荧光。FMO对照可以用来评估这种背景信号。

▶ 什么是同抗对照
同抗对照（Isoclonic）是指添加过量的未标记抗体，以检测非特异性结合。如果抗体是特异性的，那么过量的未标记抗体将导致荧光强度的降低。荧光若没有减少，则表明非特异性结合的存在。

实验对照实验对照分为几个主要类别：
•生物学阴性对照用于提供所有待测标志物的表达背景。在比较细胞经过化学或生物学处理后的蛋白质表达差异时，这种对照特别重要（图2）。

•生物学阳性对照用于证实抗体在相关细胞中的阳性染色，以表明抗体在实验中起作用。

•纵向对照/参考对照是长期研究的质量控制，可以确保实验过程中的染色一致性。





图2.诱导标志物的阴性对照。Jurkat细胞未经处理(a),或经过50uM氯喹(TocrisBioscience货号4109)处理24小时（b）。利用LC3B(1251A)抗体(NovusBiologicals货号NBP2-46892，蓝色)和匹配的同型对照(R&DSystems货号MAB1050，橙色)进行细胞内染色。用4%甲醛固定细胞,之后用0.1%皂苷透化细胞。与1ug/mL的抗体室温孵育30分钟，然后加入APC标记的兔IgG二抗（R&DSystems货号F0111）。

01样本制备各种来源的样品准备进行流式分析时需制备成单颗粒悬液，以分析活细胞或固定细胞、细胞核、微生物或小颗粒，具体取决于分析目标。拥有或开发一个好的样品制备方案，将为实验成功打下基础。在制备单细胞悬液时，主要的考虑因素是尽量减少细胞死亡和碎片。死细胞导致样品中岀现团块，这些团块往往在免疫染色中粘附游离的抗体，且表现岀更高水平的自发荧光，从而干扰荧光的准确测定。制备过程中的碎片过多则会提高噪音水平，如果过量还会干扰目标细胞的测定。
尽管流式细胞术没有神奇的诀窍（岀自HowardShapiro的流式细胞术第零定律），样品制备是可以通过以下步骤来优化：

1.获得并保持单细胞悬液。
1）过滤器是从样品中去除团块的好工具。建议从40μm过滤器开始。
2）某些染色液添加剂可减少细胞成团。
a.EDTA（~1-5mM）可减少阳离子依赖性细胞粘附。
b.DNA酶（~0.1mg/mL）能降解死细胞的DNA，并减少细胞粘附。
3）从整个组织中获得细胞群体可能颇具挑战性。通常用胶原酶和胰蛋白酶来分解组织和解离细胞。避免过度消化，这会破坏目标抗原表位或影响细胞活力。

2.了解生物样品并保持细胞活力，细胞制备的标准方案将取决于细胞来源。
1）将细胞置于冰上并使用预冷的缓冲液，有助于维持某些细胞的活力。（注意：这未必适用于所有细胞或所有应用！）
2）尽量减少处理时间、涡旋振荡、离心速度及次数，所有这些都会影响细胞活力。例如，外周血、淋巴组织和培养细胞在制备单细胞悬液时不要使用剧烈的处理方法。
3）在固定之前，尽可能快地处理细胞，以便减少实验假象和细胞死亡。
4）考虑在染色缓冲液中加入HEPES，增加CO2的缓冲。
5）了解细胞的大小以及它们是否表达任何荧光蛋白或是否具有任何荧光特性。
02样品染色
设计流式细胞术的方案和检测流程时，由于有许多变量需要优化而需要进行一些问题排查。在开始新的流式细胞术实验时，最好在各种条件下进行预实验，以便优化实验流程。在研究不同细胞或分析不同抗原时，实验方案和染色条件也许不能直接套用。抗体孵育的时间和温度可能影响受体染色，此步骤需要进一步优化（图3）。





图3.温度对染色的影响。只有在最佳染色条件下，CCR7表位才能染上。在4°C下细胞产生了低的CCR7信号。在相同的细胞制备条件下，随着抗体孵育温度升高至室温和37°C，CCR7的检测（R&DSystems货号FAB197A）得到改善。尽管CCR7染色在37°C时最为理想，但其他受体的检测也许在4°C时最佳。

抗图片体生产商通常利用固定数量的细胞来进行抗体稀释，如每个样品有100万个细胞。这对于低密度标志物如CD127而言尤其重要，因为细胞数量对染色有相当大的影响（图4）。




图4.细胞密度对染色的影响。不同细胞量的CD127+T细胞经过固定浓度的CD127APC抗体（R&DSystems 货号FAB306A）染色。100万个细胞染色效果最佳，超过200万个细胞的染色会导致信号减弱。这种损失是因为抗体稀释过度，无法与所有的抗原表位结合而导致的。

优化样品染色条件的更多建议:
1.每次都加入鉴定细胞活力的染料。
2.滴定每批试剂,以实现最佳的信噪比(一抗、二抗、活力染料等)。在右侧的例子中,1:10的稀释显示了最佳的信噪比。




3.细胞内染色还有一些特殊的考虑因素。
(1）在染色细胞内蛋白时，细胞悬液需要固定和透化，然后再加入抗体。这种固定和透化处理让抗体穿过细胞膜进入细胞内部，同时维持细胞分选所需用到的形态特征






（2）在对细胞因子等分泌蛋白进行染色时，需要蛋白质转运抑制剂（莫能菌素或布雷菲德菌素A），将细胞因子保留在细胞内。这些化合物通过破坏内质网-高尔基体转运机制，阻止新合成蛋白质的输出。对于刺激时间超过4-6小时的实验处理，分泌抑制剂可存在于整个孵育期内。若刺激时间低于4-6小时，则分泌抑制剂应在孵育的最后两小时加入
（3）不要将复合染料用在胞内蛋白染色上-这些偶联物分子量大，较难穿透细胞膜以及从细胞中洗掉。参考文献
1.Nguyen R, Perfetto S, Mahnke YD, Chattopadhyay P, Roederer M. (2013) Quantifying spillover spreading for comparing instru­ment performance and aiding in multicolor panel design.Cytometry A. 83(3):306-15.PMID: 23389989.
2.Maecker HT, Trotter J. (2006) Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.Cytometry A.69 (9):1037-42. PMID: 16888771
3.Perfetto SP, Ambrozak D, Nguyen R, Chattopadhyay PK, Roederer M. (2012)
Qualityassurance for polychromatic flow cytometry using a suite ofcalibration beads.Nat Protoc.(12):2067-79.PMID:23138348
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5.Hulspas R, O'Gorman MR, Wood BL, Gratama JW, Sutherland DR.(2009) Considerations for the control of background fluores­cence inclinical flow cytometry Cytometry B Clin Cytom., 76(6):355-64.PMID: 19575390

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导 读
和义广业【行业分析】之流式细胞仪，将系统介绍流式细胞仪究竟是什么？它可以做什么？它的市场行情怎么样？有哪些国内外的大厂都在该领域有所布局？本篇将系统介绍流式细胞仪是怎么上岗就业的，它有哪些兄弟姐妹以及它可以为我们做什么。
（一）工作过程

1、备样本并选择合适的抗体标记

从细胞培养物，血液或分解的组织中获得细胞悬浮液，将该细胞悬浮液分成数个试管进行染色，保留未染色细胞作为对照。通过添加标记有荧光探针的抗体或染色细胞成分的染料对其他细胞样品染色，如：分析细胞内蛋白质时，首先必须将细胞固定（使用福尔马林缓冲液）并进行透化（使用透化剂），以使抗体和染料进入细胞。
免疫细胞通常需要接受特定的刺激才能活化，活化的细胞会表达高水平的转录因子、细胞因子、趋化因子以及其他可通过流式细胞检测的调节因子，通过对激活因子的选择来确定抗体（流式抗体涵盖：CD标记物、转录因子、细胞因子、趋化因子和生长因子、信号通路标记物，如磷酸化蛋白）。
2、将细胞洗涤重悬

细胞与抗体或染料孵育后，将细胞在缓冲液中洗涤，然后重悬在基于盐的缓冲液中。
3、样品上样到仪器

典型的实验从单细胞悬浮液中的荧光标记细胞开始，可以使用任何颗粒类型的样品。将样品置于流式细胞仪上，样品被吸到仪器中，细胞悬浮在一种被称为鞘液的生理缓冲液，流体系统（管道、泵和阀）将初始样品悬浮液排列成单列细胞流，并使细胞通过流式细胞仪以进行分析。
4、激光检测

细胞与激光发生相互作用的地方称为激光检测点（激光拦截）（图），这是荧光检测发生的地方。当激光束照射到单个细胞时，一些光会撞到细胞内的物理结构，导致光线散射。这种光散射可被测量，并且与相对细胞大小和细胞内的结构相关。这些测量称为前向角散射（FSC）和侧角散射（SSC），FSC和SSC取决于收集光的位置相对于激光路径的角度。几乎同时，来自激光器的光激发与细胞相关的所有荧光团，产生荧光发射。所有这些光被检测器收集并通过流式细胞仪的电子元件进行处理。通过激光检测点之后，流体系统会将不需要的细胞输送到废液桶中。在细胞分选仪中，细胞将在激光检测点被分选和输送到收集管中，以供后续实验使用。



图 激光监测点

5、分析数据
通过收集的流式细胞仪数据创建直方图和点图以进行分析。
下图为单参数直方图，X轴表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，Y轴表示细胞数，通过直方图可直观单个参数的细胞数量。




图 单参数直方图

下图为双参数二维点图，其中X坐标表示该细胞一参数的相对含量，Y坐标表示该细胞另一参数的含量，通过获得的数据可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞区分开，从而可以分别分析各细胞亚群的统计数据。



图 双参数直方图

（二）分类
流式细胞仪除了上面介绍的的传统的细胞仪之外还有一些其他类别的细胞仪，如细胞分选仪、质谱流式细胞仪、成像细胞仪等，下面我们就其他类别的进行简单介绍。
1、质谱流式仪

质谱流式细胞仪结合了飞行时间质谱仪和流式细胞仪，其技术原理是采用金属同位素标记特异性抗体来标记细胞表面和内部的信号分子（蛋白），将标记好的细胞通过流式被分离成单个细胞依次进入电感耦合等离子体质谱，单细胞首先被等离子体炬离子化为一个独立的离子云，随后离子云中的各种标签金属离子被质谱精确检测出来，得到单细胞的质谱数据，最后数据被转换为标准的流式数据，通过生信分析团队进行多维度的数据分析，实现对细胞表型和信号网络的精细表征以及价值信息的有效挖掘（如图所示）2。
流式质谱相比于传统的流式有诸多优势，如通量较大，＞40个项目，目前最多可拓展到130余项，拓展性好；细胞内不含荧光，没有背景噪音，稳定性高，CV≤3%；ICP质谱灵敏度高，金属离子彼此间没有信号干扰，不需要补偿。但是同时也有检测速度相对较慢（1000 个细胞/秒）和不可回收细胞用于后续检测的不足。




图 质谱流式的技术原理

2、成像细胞仪
成像流式细胞仪是将传统流式细胞术与荧光显微镜相结合，它允许在单个细胞和群体水平上快速分析样品的形态和多参数荧光3，可以跟共聚焦显微镜或荧光显微镜一样跟踪单个细胞内的蛋白质分布，也可以像流式细胞仪一样处理大量细胞，在多种应用场景如细胞信号传导、共定位、DNA损伤和修复中发挥作用。
3、细胞分选仪

细胞分选仪是一种特定类型的传统流式细胞仪，它可以纯化和收集样品以供进一步分析，其技术原理细胞分选机通过高频振荡液体样本流以产生液滴来分离细胞，然后液滴被赋予正电荷或负电荷并通过金属偏转板，在那里它们根据其电荷被引导到特定的收集容器。收集容器可以是离心管、载玻片或96孔板/384孔板。常见的细胞分选仪有石英比色皿和“空气激发/喷射”两种类型的，它们的不同之处在于激光检测点的位置，石英比色皿细胞分选仪具有固定的激光对准，更容易为分选做好准备，“空气激发/喷射”细胞分选仪需要每天校准激光，设置起来更困难，但更适合小颗粒检测。
（三）应用

1、免疫学

-免疫分型：是流式细胞术较常见的应用，其利用荧光偶联抗体与细胞表面对应的抗原特异性结合，之后利用流式细胞仪根据细胞表面的荧光对细胞做出分析。
-抗原特异性反应：使用特定抗原刺激细胞，通过MHC多聚体对特定的抗原的结合，之后与识别该抗原的T细胞结合，用来表明T细胞对特定抗原的反应水平，从而寻找细胞因子产生、细胞增殖、细胞激活、细胞记忆或抗原识别等。
-胞内因子检测：通过蛋白转运抑制剂处理使细胞产生的各种细胞因子在胞内积累，后对细胞进行活力标记和细胞表面标记染色并检测。
-细胞增殖检测：通过靶向与细胞增殖相关的事件来检测，如将胸苷类似物 (BrdU) 掺入复制中的DNA、增殖相关抗原(Ki67、PCNA)的表达检测等。
-细胞凋亡检测：通过与凋亡相关的级联事件的靶点进行细胞凋亡检测。
2、分子生物学

-荧光蛋白检测：荧光蛋白常被用作蛋白质表达的标记，即细胞被转染含有启动子序列、目的基因序列和荧光蛋白序列的质粒。当目的基因表达产生目的蛋白时，其下游的荧光蛋白基因共同表达，从而使细胞发出荧光信号。该技术可应用于体内追踪移植细胞，检测细菌或病毒感染，以及鉴定基因功能等。
-细胞周期检测：通过使用饱和量的DNA结合染料对DNA进行染色，个别染料可以进入活细胞，在不伤害细胞的情况下染色DNA，比如Hoescht 33342。在细胞周期检测中，以低流速线性放大的方式采集样本，然后使用倍性建模软件进行分析，以确定细胞周期阶段。
-RNA检测：RNA流式细胞术将传统流式细胞术和荧光原位杂交(FISH)结合应用，检测RNA表达和蛋白表达，当无法检测目标蛋白表达，但可以检测RNA表达时，流式细胞仪仍可以发挥作用。
-细胞分选：利用流式细胞分选仪来分离纯化细胞或颗粒以供进一步分析。一般来讲，任何具有荧光的细胞或颗粒都可以被分选，细胞可以被分选到96孔板、384孔板、管中和载玻片上。常见的样本有表达荧光蛋白的转染细胞、干细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤细胞和白细胞群。
3、其他应用

绝对细胞计数：可用于任何免疫分型研究，该技术利用随样本一起采集的已知浓度的荧光珠对样本进行分析，并将目的细胞群的数量与在同一样本中获得的荧光珠数量进行比较，以计算生成单位体积内的细胞数量。
小颗粒检测和分选：使用高灵敏度的流式细胞仪可以检测和分选外泌体和其他亚微米颗粒。
定量流式细胞分析：用流式细胞仪对细胞或微粒上标记的荧光分子进行定量分析，从而对细胞的生物分子进行精确测量，如每个分子表达的平均分子数、抗原数等。定量流式细胞分析不同于以往的相对荧光强度或阳性细胞百分率测量，它的检测更为准确、灵敏，如在获得性免疫缺陷综合症和“非典”的研究与治疗中，对外周血中的CD4+T淋巴细胞进行绝对记数来反映病情进展及监测疗效。
磁珠阵列测定：磁珠阵列测定是涂有针对特定可溶性蛋白质或核酸抗体的磁珠组，每个磁珠都有已知数量的荧光和特定的靶标，该靶标为磁珠在基质中的位置。将100多个珠子的集合与目标样品一起孵育，用荧光报告器处理，然后在流式细胞仪上用至少2个激光器获取以检测2种不同的荧光染料，特殊软件根据荧光计算分析物量。
吞噬作用测定：使用荧光标记的生物颗粒或细菌，可以使用流式细胞术检测吞噬作用。
参考文献：
[1]资源来自ThermoFisher Scientific官方网站
[2]资料来源：普罗亭官网
[3]Barteneva NS, et al. Imaging flow cytometry: coping with heterogeneity in biological systems. J Histochem Cytochem. 2012;60(10):723
[4]McKinnon KM. Flow Cytometry: An Overview. Curr Protoc Immunol. 2018 Feb 21;120:5.1.1-5.1.11. doi: 10.1002/cpim.40. PMID: 29512141; PMCID: PMC5939936.
封面图来源：图片来自网络，侵删
作者声明：感谢本文参考资料作者，文中观点仅供参考，不恰当之处还望包涵指正，资料内容侵删。
作者：李芳 武瑾嵘
排版：大大怪

检验医师

流式细胞术（FCM）是一种基于激光的技术，用于生物颗粒的多参数分析。随着技术的发展，FCM已进入许多使用领域。FCM也用于免疫表型研究。因此，它可以用于确定细胞亚群、谱系、细胞分化和激活阶段以及克隆性。随着FCM分析的发展，B细胞发育和分化的各个阶段已变得可识别。此外，FCM已经开始识别和表征几个不同B细胞亚群和相关诊所中的表达谱。
流式细胞术分析血小板功能有较多优势。它可以血小板直接在全血的生理环境中进行分析（包括红细胞和白细胞，两者都影响血小板活化）。样本的简化操作可防止人为的体外活化和血小板亚群的潜在损失。流式细胞术方法主要用于检测血小板表面膜的特异性激活依赖性修饰谱。此外，随着针对新功能表位的新单克隆抗体的开发，它们比较容易地并入分析中。全血流式细胞术可检测到仅有1%部分活化血小板的亚群，只需微量（~5µL）血液，使用流失细胞仪还可以准确分析严重血小板减少症者的血小板。如果抗体试剂可用，血小板的流式细胞术评估同样适用于动物研究。此外，非物种特异性的非抗体试剂（例如，自体配体[FITC纤维蛋白原]、钙指示剂、F-actin探针[phalloidin]、核苷酸染料[噻唑橙]、活性染料和膜联蛋白V）等也常用在动物研究中。



蛋白电泳仪-天能电泳仪-tanon凝胶成像仪-发光检测仪-实验室设备厂家流式细胞术其实是一个平台，可在此平台上执行数十种非常不同、高度专业化的分析，并提供同时执行许多这些分析的能力。正是这种分析的多因素性质使FACS成为当今免疫生物学的常用工具。FACS分析得出的数据具有较高的信息密度，这对于阐明极其复杂的免疫系统是可行的。20世纪以来，FACS技术一直在快速发展。这一演变包括不断将应用程序注入临床环境——事实上，事实上，几乎每个现代医院都至少有一个这样的仪器，这一事实已经证明了FACS在诊断和预后方面的作用。目前基础研究实验室正在开发的化验，据推测将在未来十年成为医院环境中的常规化验。
流式细胞术有助于AML亚类化，而无复发性细胞遗传学异常。例如，根据WHO分类（FAB分类下的AML M0），根据定义，其通过细胞化学缺乏髓过氧化物酶反应性，依赖于FC建立髓系。在急性粒单核细胞白血病或急性单核细胞-单核细胞性白血病的偶发病例中，细胞化学显示非特异性酯酶活性很低，FC可以证实单核细胞分化。FC鉴定白血病髓母细胞上的巨核细胞相关抗原，如CD9、CD36、CD41和CD61，为诊断急性巨核细胞白血病（FAB分类下的AML M7）提供了重要支持，并有助于将其与AML M0区分开来。
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流式细胞术是一种对溶液中单个细胞或颗粒进行快速、多参数分析的技术。流式细胞仪利用激光作为光源，照射在细胞上，产生散射光和荧光信号，由检测器如光电二极管或光电倍增管读取。之后，这些信号被转换成电子信号，由计算机进行分析，并写入标准格式(.fcs)数据文件。另外，细胞群可以根据其荧光或散射光的特性进行分析或分选。



用于流式细胞术的仪器在过去的几十年里不断“进化”着，以满足越来越多的科研与临床应用需求。本文将为大家简单介绍几种流式细胞仪。

传统流式细胞仪


传统的流式细胞仪由液流、光学和电子（检测分析）三个系统组成。液流系统主要由鞘液(通常是一种缓冲盐水溶液)构成。在一定压力下，鞘液将细胞或颗粒聚焦在一条直线，并将其输送到激光拦截点。

光学系统由激发光 (激光器)和收集光 (光电倍增管或PMTs和光电二极管)组成，产生用于分析样品的散射光和荧光信号。一系列的双色向滤光片可引导荧光到特定的探测器，以便每一个单独的荧光色素可以被检测和测量。更具体地说，双色向滤光片只允许波长较短或较长的光通过，并以一定角度反射不能通过的光。例如，450双色向长通滤光片(DLP)让波长大于450 nm的光通过滤光片，并以一定角度反射较短波长的光，发送到另一个探测器。带通滤光片只允许一定波长范围内的荧光通过。例如，450/50带通滤光片只允许波长为450 +/- 25 nm的荧光通过。

电子系统将探测器发出的信号转换成可以被计算机读取的数字信号。

常见的多激光系统通常有20个参数(FSC, SSC和18个荧光探测器)。目前，一些新的仪器正在引入5个或更多的激光器，并设置30-50个参数，但这并不常见。传统流式细胞仪使用的最常见的激光是488 nm(蓝色)、405nm(紫色)、532nm(绿色)、552nm(绿色)、561 nm(绿黄色)、640 nm(红色)和355 nm(紫外线)，还有一些不常见的激光可用于特定用途。此外，还有一些仪器已经用电子崩光电二极管(APD)取代光电倍增管(PMT)用于荧光检测，目的是提高检测的灵敏度。




流式细胞仪系统组成示意图


声波聚焦流式细胞仪


声波聚焦流式细胞仪可以使用超声波更好地将细胞聚焦于一条直线，进行激光照射。即使在较高的进样速度下，声波聚焦技术也可以精确地将细胞定位在液流的中心，因此细胞信号的变异系数较小，数据质量更高。作为对比，同样在高进样速度下，传统的流体动力学聚焦由于鞘液压力相对变小，样本流的中心部分变宽，导致信号变异系数增大、数据质量下降。此外，声波聚焦的方式允许更高的上样量，并能够减少样品堵塞。声波聚焦流式细胞仪可以利用多达4种激光和14个荧光通道对样本进行检测。




声波聚焦和流体动力学聚焦对比示意图

细胞分选仪


细胞分选仪是传统流式细胞仪中的一种特殊类型，它允许用户根据所需参数，选择特定的细胞群或颗粒群，然后将这些细胞或颗粒引导到收集容器中，以供进一步研究。

细胞分选仪对样品液流进行高频振荡，以产生液滴来分离细胞。然后，液滴被赋予正电荷或负电荷，并通过金属偏转板，在那里它们根据电荷被导向一个特定的收集容器。收集容器可以是管状、载玻片或板状(96孔或384孔较为常见)。

细胞分选仪有两种类型，石英比色皿型和喷气管型，它们的不同之处在于激光照射点的位置。石英比色皿型细胞分选仪具有固定的激光照射线路，更容易为分选做好准备。喷气管型细胞分选仪需要每天对激光照射线路进行校准，设置起来更困难，但更适合小颗粒检测。




流式细胞分选仪

成像细胞仪


成像流式细胞仪(IFC)结合了传统的流式细胞术和荧光显微镜系统，这允许在单细胞和群体细胞水平上快速分析样品的形态和多参数荧光。IFC可以像共聚焦显微镜或荧光显微镜那样跟踪单个细胞内的蛋白质分布，也可以像流式细胞仪那样处理大量细胞。它们在多种应用中发挥关键作用，如细胞信号传导、共定位研究、细胞间相互作用、DNA损伤和修复，以及需要对大量细胞的细胞定位与荧光表达进行协调的应用。

质谱流式细胞仪


质谱流式细胞仪结合了飞行时间质谱仪和流式细胞仪的功能。使用这种仪器时，细胞用重金属离子标记抗体进行标记，而不是荧光标记抗体，并使用时间飞行质谱法进行检测。但质谱流式细胞仪不具备FSC 或 SSC 光检测功能，因此无法使用常规方法检测细胞聚集体。此外，质谱流式细胞术不具有细胞自身荧光信号，试剂不具有与荧光标记相关的发射光谱重叠，因此不需要补偿。然而，样品在分析过程中会被破坏，因此无法进行细胞分选，并且采集速率远低于标准流式细胞仪。

用于微珠阵列分析的细胞仪


多重微珠阵列在分析小体积样品中的大量分析物方面已变得流行。简单地说，这些检测利用在特定通道中具有已知荧光量的捕获珠和由单独的激光检测到的报告分子，来量化与特定珠相关的捕获分析物的数量。

光谱分析仪


多参数流式细胞术的挑战之一是荧光色素之间的补偿(或消除光谱重叠)。一种新型的流式细胞仪，光谱分析仪就是专门针对这一问题而设计的。光谱分析仪测量多色样品中每个荧光色素的整个荧光发射光谱，以创建光谱指纹。然后在分析过程中，每个光谱是未混合的，为每个荧光色素提供一个纯信号。光谱分析正逐渐取代传统的PMTs作为高维流式细胞术的检测方法。