技术分享 | 蛋白定量有多难？掌握方法再说话

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蛋白定量是生物学研究中不可能或缺的一个步骤，根据其目的可分为蛋白质的“总定量”和特定蛋白的“个别定量”。在判断蛋白有无表达时，先将细胞裂解，验证细胞裂解是否彻底，或对样品进行平时实验或者标准化保存，则要对细胞裂解液进行蛋白定量；进一步判断蛋白的表达情况、产量如何，则需要将已纯化的蛋白定量；纯化好的蛋白进行下一步的应用，如标记报告酶或者生物素等，也需要先将蛋白定量，以便计算试剂的最佳工作浓度。
蛋白质的结构复杂、种类繁多、功能各一、分子量存在巨大差异，目前还没有一个理想且通用的蛋白定分析方法。如今最常见的方法主要有以下几种：
紫外分光光度法   PART.01
蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，在最大吸收波长处，吸收光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯-比尔定律，故可作为蛋白质定量测定的依据。
该方法是最快的蛋白质定量方法，但由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量不同，如要准确定量则应有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或者知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰，其中核酸(嘌呤和嘧啶)的影响尤为严重。核酸的最大吸收峰是在260nm，因此若溶液中存在核酸，必须同时测定OD260与OD280，然后根据两种波长的吸收度比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。
优点
操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化蛋白质的微量测定。
缺点
（1）当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，会产生—定误差。
（2）混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。
双缩脲法   PART.02
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
优点
较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
缺点
灵敏度差，常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质测定。
Lowary蛋白定量法  PART.03
Lowary法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，在加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowary法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3-15倍，为双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
优点
微克级高灵敏度定量测定，稳定。
缺点
（1）受植物体内存在的酚类物质干扰。
（2）去污剂如TritonX-100，SDS，NP-40的浓度超过0.2%时会影响定量结果。
考马斯（Comessie)亮蓝法  PART.04
考马斯亮蓝法又称Bradford法，是1976年由Bradford建立的蛋白质定量测定法。考马斯亮蓝G250是一种有机染料，在游离状态下呈红色，它的最大吸收峰在465nm，在稀释溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸结合后变为蓝色，这种结合具有高敏感性，此时吸收峰也从465nm变为595nm,在一定范围内，光密度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。
优点
（1）操作简便、快速；检测灵敏；重复性好。
（2）显色迅速，约2分钟内可完成染料与蛋白质的结合，所现颜色至少在1小时内是稳定的。
（3）与改良Lowary法相比，干扰物质较少。
缺点
（1）当样品中存在较大量的SDS、TritonX-100等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。
（2）考马斯亮兰G250染液不宜久存，以1-2月为宜。
BCA法 PART.05
BCA( Bicinchoninic acid)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowary法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
优点
（1）灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl。
（2）操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便。
（3）测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween20，60，80。
（4）在20-200μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。
（5）检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝蛋白定量法。
（6）经济实用，除试管外，测定可在微板孔中进行，大大节约样品和试剂用量。
缺点
受螯合剂和略高浓度的还原剂（EDTA小于10mM，DTT小于1 mM，巯基乙醇低于1mM）的影响。
以上是针对全蛋白质的“总定量法”，然而许多实验需要对溶液中特定蛋白进行定量分析，即针对特定蛋白质的“个别定量”。针对特
定蛋白定量常用的方法有酶联免疫吸附试验法（ELISA），免疫印迹分析法（WB）和质谱检测（MS）。
1、ELISA
ELISA是溶液中特定蛋白定量的一种常用方法，通常是在96孔板上进行，关键步骤是特定抗原/蛋白的固定。具体来说，ELISA有不同变种。
直接或间接ELISA
特定抗原/蛋白直接吸附到检测板，封闭未被抗原包被的孔板表面，然后在孔板中加入酶标（直接ELISA）或未酶标（间接ELISA）的第一抗体，在测试孔板中，一抗与抗原/蛋白相结合。对于未酶标的第一抗体，加入酶标的第二抗体与第一抗体结合。最后，加入酶底物（通常是四甲基联苯胺TMB或碱性磷酸酶ALP）使溶液发生颜色变化然后使用分光光度计检测。颜色变化与蛋白质浓度是直接相关的。
直接ELISA的优点是速度快，并且没有第二抗体的交叉反应问题，但局限是第一抗体的标记可能是费时和昂贵的。此外，信号放大是最弱的。因此，更常用的是
夹心ELISA
特定抗原/蛋白结合在孔板表面包被的第一抗体（捕获抗体）和酶标的第二抗体（检测抗体）之间，第二抗体比较容易买到，但可能会发生第二抗体的交叉反应。
任何ELISA测定蛋白质浓度的一个重要环节都是蛋白质标准曲线，通常是连续稀释已知浓度的蛋白质，从而绘制标准曲线。

2、WB
WB只能半定量。通过凝胶电泳把原始或变性的蛋白质分开，把蛋白质转膜（硝酸纤维素或PVDF），然后使用特定的酶标抗体检测。最后，加入适当的底物（化学发光底物）产生可检测的信号。虽然WB比ELISA更费时，但是WB不仅可以对特定的蛋白进行定量，而且可以在实验中同时检测蛋白质修饰。

3、MS
MS是蛋白质定量的新兴方法。在蛋白质组学分析中，除了蛋白定性之外，一个重要的步骤就是对特定的蛋白进行定量分析。MS定量蛋白的方法有很多。
常用的方法是较重的稳定同位素碳（13C）或氮（15N）加入到第一个样本（多肽或蛋白质），而相应的轻同位素（12C和14N）加入到第二个样本（内标），然后混合这两个样本进行分析。由于两个样本的质量差，用质谱分析仪测定的两个样本峰强度的比值就相当于其相对丰度比。
质谱蛋白定量的第二种方法，可以不用标记样本，即用基质辅助激光解吸/电离 - MALDI分析。
使用质谱这种通用方法可以在一次实验中同时进行定量和定性检测。但这种方法需要的检测仪器很昂贵，从而限制了该方法的使用。
总之，虽然测定蛋白质含量的方法很多，但还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。

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