基因组测序技术有哪些？

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据称LifeTechnologies公司发布台式基因测序仪IonProton，只需1000美元即可在一天时间内完成个人全基因组测序。这与之前的技术有哪些区别？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/20149849

卡卡

从1977年第一代测序技术问世以来，基因测序已有43年的发展历程。当前，基因测序技术已发展到第四代，即纳米孔测序技术。提及43年间的基因组测序技术，让我们首先回顾一下基因测序的历史。第一代测序技术又称Sanger测序。1977年Sanger测定了第一个基因组序列—噬菌体X174全场5373个碱基，人类以此为开端步入基因组学时代。第一代测序技术的测序读长可达1000bp，准确率高达99.999%，但由于其通量低、成本高等特点，并没有得到大规模应用。而后发展而来的二代测序技术，即NGS技术，是测序技术的革命性进步，能够一次对上百万条DNA分子进行序列测定，使得对一个物种的转录组和全基因组进行细致全貌的分析成为现实。以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。纳米孔测序技术（又称第四代测序技术）是最近几年兴起的新一代测序技术。目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION纳米孔测序仪。它具有单分子测序，测序读长长（超过150kb），测序速度快，测序数据实时监控，机器便于携带等特点。目前应用范围最广的基因测序技术仍是二代测序。以诺禾致源为例，公司在近些年一直在完善自身NGS技术的实力。2014年和2016年诺禾致源两次购买Illumina HiSeq X Ten，同时诺禾致源还拥有HiSeq 4000、HiSeq 2500／2000、MiSeq、NextSeq 500 和Life Ion Proton（DA8600）等最先进的基因测序仪。2018年9月4日，CFDA评审委员会批准天津诺禾致源生物信息科技有限公司配套的“人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）”分析软件上市，这也是国内首个基于肿瘤NGS数据分析软件的III类医疗器械注册证。2020年3月，诺禾致源正式宣布面向全球推出NGS领域首个多产品并行的柔性智能交付平台Falcon。这一多产品柔性化智能产线的发布，突破了传统的NGS测序方式。与此同时，伴随智能交付平台的投产使用，也将有助于进一步定义行业内NGS测序标准，推动行业生态健康有序的发展。在不断优化NGS测序技术服务的同时，诺禾致源也针对第三代测序技术进行了相应的布局。2017年1月16日，诺禾致源与Pacific Biosciences（PACB）共同宣布：诺禾致源引进10台Sequel用于全基因组测序、全长转录组测序（Iso-Seq）以及靶向测序服务。2018年9月，诺禾致源与 Oxford Nanopore Technologies达成战略合作关系，诺禾致源引入 Oxford Nanopore 测序服务平台，全面推进三代测序的应用和发展。随着测序成本的降低，诺禾致源的三代测序服务也被广泛应用于农业学、医学等科学研究领。基因测序技术的革新相当迅速，如果题主对这方面感兴趣，可以多追踪一下如诺禾致源这样的国内顶尖基因科技公司的动态。相信可以从中掌握了解到行业的相关信息。

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基因测序仪：生命密码「翻译机」
《圣经》中记载道，神用 6 天创造出了宇宙万物。第 6 日，耶和华神用地上的尘土造人，将生气吹在他鼻孔里，他就成了有灵的活人，名叫亚当。
然而，只有单纯性别的人类是无法繁衍后代的，上帝便拿掉男人的一根肋骨，创造了女人夏娃，使人类有了两性，才有了繁衍的可能。这是西方上帝造人的过程。
同样，在中国上古神话传说的其中一个版本里，也有创世女神女娲。相传，她以泥土仿照自己抟土造人，创造并构建了人类社会，又替人类立下了婚姻制度，因此被后人奉为「神媒」。
从神话到现实，人类从未停止对生命起源之谜的探索。关于生命的终极追问是：我们到底从何而来？这也是科学家们最想破解的难题。
1871 年，达尔文在《物种起源》中首次提出「生物演化论」，世界上现存的数百万个物种，是从大约 30 多亿年前的原始生命开始不断演化的结果。之后，在其另一部伟大著作《人类的由来及性选择》中，达尔文又提出「人猿共祖」的观点。科学家根据基因序列推算出，人类与现存的最近亲缘物种黑猩猩大约分化于 500 万年前。
地球上现存 70 多亿人最近的共同祖先，可以追溯到大约 30 万年前。中国民间流传着「同姓的人 500 年前是一家」的说法。的确，我们彼此之间都有不可思议的相似之处。若把我们自己的基因与其他任何人的基因相比较，平均来说，都有 99.5% 或更高的相似度。
当然，正如我们看到的，除了高度相似的基因以外，人与人之间也会存在一些与生俱来的差别，比如皮肤和眼睛的颜色，这些都是由基因控制的。司法人员正是利用这一点进行断案。他们可以根据毛发、血液等痕迹，通过基因检测技术来确认犯罪嫌疑人的身份。
我们之所以能够推算人与黑猩猩的分化时间，司法人员之所以能够鉴别犯罪嫌疑人的身份，实际上都是靠检测一段长长的生物大分子——DNA 来实现的。DNA 的基本组成单元含四种核苷酸，分别用 A、T、C、G 四个字母表示，基因信息的关键就在于 DNA 序列中 A、T、C、G 的完整排列顺序。
自 20 世纪 70 年代以来，基因测序技术已经成为打开基因宝藏的金钥匙，帮助我们揭开了无数令人惊叹的生命奥秘。
打开生命宝藏的金钥匙

1971 年，吴瑞将引物延伸（primer extension）用于 DNA 测序，启发了后人的测序研究，成为 Sanger 测序法的重要一步，而引物延伸也被用于其他两项诺贝尔奖工作，即凯利·穆利斯的 PCR（聚合酶链式反应）和迈克尔·史密斯的定点突变。

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清风寡欲

刚好，前段时间开了知乎专栏，计划专门定期更新关于NGS技术、生物信息和基因组学的内容。这个答案就修改自专栏的第一篇文章：从零开始完整学习全基因组测序（WGS）数据分析：第1节 测序技术，在这里我把其中关于基因测序技术相关的内容抽取了出来，这包含了整个基因测序技术的发展历史，希望对大家有用。另外，目前已经处于淘汰边缘的技术这里就不再述说了，包括：ABI SOLID、Roche 45等这些早期第二代测序技术。
在正式回答之前，我还是多说一句：所谓测序，简单来说其实就是将DNA化学信号转变为计算机可处理的数字信号。

以下正文：
现在的基因测序已不同于3-5年前了，可以说已是时下热门，但它从第一代开始发展至今其实已经有40年的时间了！
在这个技术发展的更迭历程中，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势来看第二代短读长测序技术在全球范围内上仍然占有着绝对的垄断位置，但第三测序技术也已在这几年快速地发展着。测序技术的每一次变革和突破，都对基因组学研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。所以在里我将对当前最主流的测序技术以及它们的测序原理做一个比较全面的介绍。



图1. 测序技术发展历程

第一代测序技术

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，由桑格老人家（那时他还年轻）测定了第一个基因组序列——噬菌体phiX-174，全长只有5,375个碱基。虽然与今日的技术比起来根本不算什么，但自此之后，人类获得了窥探生命本质的能力，并以此为开端真正步入了基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为基础进行测序的。Sanger法的核心原理是：由于ddNTP（4种带有荧光标记的A,C,G,T碱基）的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA的合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分别为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），然后利用凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2. Sanger）。这个网址为Sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
但值得注意的是，在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外其实还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、连接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID使用的测序方法，但他们的核心手段都是利用了Sanger中可中断DNA合成反应的ddNTP。



图2. Sanger测序发原理

第二代测序技术

总的来说，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1,000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/HiSeq技术和ABI公司的SOLID技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术在大幅度提高测序速度的同时，还大大地降低了测序成本，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但其序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。
图3. 是第一代和第二代测序技术测序成本作了一个简单的比较，可以看出自第二代测序技术发展出来之后，历史开始发生根本性的改变，测序的成本开始快速实现断崖式下降，也就是业内经常提到的超摩尔定律现象。



图3. 测序成本比较（来源：NIH网站）

接下来我以illumina（目前最大、最成功的第二代测序技术公司）的技术为基础简要单介绍第二代测序测序技术的原理和特点。
目前illumina的测序仪占全球75%以上，以HiSeq系列为主。它的机器采用的都是边合成边测序的方法，主要分为以下4个步骤：



图4. illumina测序原理（来源：illumina官网）

1）DNA测序测序文库制备，图4-1
简单来说就是把一堆乱糟糟的DNA分子用超声波打断成一堆在一定长度范围内的小DNA片段。目前除了一些特殊的需求之外，基本都是打断为300bp-800bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头【注】，构建出单链DNA文库，以备测序之用；

【注】接头在illumina中一般分为P5和P7接头，其中一个带有和flow cell上的探针反向互补的序列，以完成待测序列和探针结合的作用，另外一个接头带有barcord序列以区分不同的样本。连接接头反应，其原理为序列打断后加碱基A，随后接头T单碱基互补连接。

2）测序流动槽（flowcell），图4-2
flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，也是核心的测序反应容器——所有的测序过程就发生在这里。当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell时会随机附着在flowcell表面的槽道（称为lane）上。每个flowcell有8个lane（图5），每个lane的表面都附有很多很多的接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对，这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因，并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增，理论上这些lane之间是不会相互影响的，也即是说，测序时他们都在独立反应。



图5. flowcell（实物 VS 示意图）

3）桥式PCR扩增与变性



图6. 桥式PCR扩增（来源：illumina官网）

这是二代测序技术的一个核心特点。桥式PCR以flowcell表面所固定的序列为模板，进行桥形扩增，如图6所示。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有原来单个DNA模板的很多分拷贝，这一过程的目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大，以达到测序所需的信号要求。
4）测序，如图4-4和图7所示



图7. 边合成边测序（来源：illumina官网）

测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基。同时在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号（图7），并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。
Illumina的这种每次只添加一个dNTP的技术特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在0.7%-1%左右。测序周期以人类基因组重测序为例，30x-50x测序深度对于Hisq系列需要3-5天时间，而对于2017年初最新推出的NovaSeq系列则只需要40个小时！
表1. 测序量比较（双流动槽为例，如为单流动槽则测序量减少为下表的一半，时间不变）


*一次测序的数据总产量的单位Gb，不是计算机字节，而是测序碱基的数目（Giga base）*



图8. NovaSeq与其他测序仪测序通量的比较（来源：illumina官网）

上面表1和图8是NovaSeq和其他测序系列的比较，数据相当好。按照这个数据量估算，一台NovaSeq 6000（S4）在跑满的情况下，一年就可以测序6400多人！而且按照以往的经验，illumina的官方公布的数据都是偏于保守的，我们在实际的使用过程中发现高质量（Q30）的read其实占到了总数据的90%以上，远高于官方公布的75%，数据的总产量也同样更高。

第三代测序技术

这是一个新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术为标志，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，以下图9是PacBio SMRT技术的测序读长分布情况，平均达到10Kb-15Kb，是二代测序技术的100倍以上，值得注意的是在测序过程中这些序列的读长也不再是相等的，下文有解析！



图9. PacBio SMRT 测序read读长分布（来源：PacBio官网）

PacBio SMRT
PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体（如同flowcell）。基本原理是： DNA聚合酶和模板结合，用4色荧光标记A,C,G,T这4种碱基（即是dNTP）。在碱基的配对阶段，不同的碱基加入，会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。



图9. PacBio SMRT 测序原理

这个DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。PacBio SMRT技术的一个关键点是在于如何将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。这些小孔的直径是有严格要求的，如果直径大于微波波长，能量就会在衍射效应的作用下穿透面板从而泄露出来（光波的衍射效应），从而与周围小孔相互干扰（光波的干涉）。如果孔径能够小于波长，那么能量就不会辐射到周围，而是保持直线状态，从而可起到保护的作用。同理，在一个反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔,，即 ZMW(零模波导孔)，外径100多纳米，比检测激光波长小(数百纳米)，激光从底部打上去后不会穿透小孔进入上方的溶液区，能量会被限制在一个小范围(体积20X 10-21 L)里（图10-A），正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅仅只是来自于这个小反应区域，孔外过多的游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景噪音降到最低的目的。
PacBio SMRT技术除了能够检测普通的碱基之外，还可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测碱基的表观修饰情况，如甲基化。因为假设某个碱基存在表观修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，那么相邻两峰之间的距离会增大，我们可以通过这个时间上的差异来检测表观甲基化修饰等信息（图11）。



图11. PacBio SMRT 检测甲基化修饰（来源：PacBio官网）

SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但这么快的测序速度也带来了一些明显的缺点——测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），可以达到10%-15%，而且以缺失序列和错位居多，但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在一定的碱基偏向，因此可以通过多次测序来进行有效纠错。

Oxford Nanopore
Oxford Nanopore 的MinION是另一个比较受关注的第三代测序仪，俗称U盘测序仪，它真的很小，我亲手拿过，并拆过，图12（左）！这家公司开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术相比都不一样，它是基于电信号而不是光信号的测序技术！



图12. Oxford Nanopore MinION

这个技术的关键点在于他们所设计的一种特殊纳米孔，孔内共价结合分子接头。当DNA分子通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），最后高灵敏度的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基（图13）。



图13.MinION 测序原理

纳米孔测序以及其他第三代测序技术，有可能会彻底地解决目前第二代测序平台的诸多不足。另外，MinION的主要特点是：读长很长，而且比PacBio的都长得多，基本都是在几十kb上百kb以上，最新的数据显示可以达到900 kb！错误率是5%-15%，也是随机错误，MinION最大的特点除了极小的体积之外，就是数据将是可实时读取的，并且起始DNA在测序过程中不被破坏！这真是个可以上天的能力。然鹅，遗憾地多说几句，目前还没真正公布，细节也不知，自从2012开过一次发布会之后，就没什么声响了。
这种纳米孔单分子测序仪还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。下面是对PacBio和Oxford Nanopore这两家第三代测序技术公司的测序仪做的一个简单比较，可以看出其实成本还是蛮高的，质量也只是还行，期待他们的下一次进化吧。


总结

以上，便是对各代测序技术的原理做了简要的阐述。在这个比较的过程中，可以看到测序成本，读长和通量是该测序技术先进与否的三个重要指标。其实第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外，测序的核心原理都来自于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是通量大大提升，成本大大减低，使得昔日王榭堂前燕，可以飞入寻常百姓家。总之，只有变成白菜价，才能真正对大众有意义；但它的缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，但这个技术还不是很成熟，需要再进化，成本也偏高。



图14. 全球测序仪数量分布

参考文献

1. Sanger, F. & Nicklen, S. DNA sequencing with chain-terminating. 74, 5463–5467 (1977).
2. Mardis, E. R. Next-generation DNA sequencing methods. Annual review of genomics and human genetics 9, 387–402 (2008).
3. Shendure, J. & Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature biotechnology 26, 1135–45 (2008).
4. Metzker, M. L. Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics 11, 31–46 (2010).
5. Niedringhaus, T. P., Milanova, D., Kerby, M. B., Snyder, M. P. & Barron, A. E. Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies. 4327–4341 (2011).
6. Rothberg, J. M. et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature 475, 348–52 (2011).

最后，还是按照惯例，喜欢更多的生物信息和组学文章，欢迎搜索并关注我的微信公众号ID:  helixminer

同花顺

关键词：semi-conductor， non-optic (半导体而非光学成像)
Next Generation Sequencing 的三大平台：Illumina的HiSeq/MiSeq，ABI的Solid，Life Tech的Ion PGM/Torrent （话说454算么，通量不高的说）
三者都是边合成边测序的（sequence by synthesize），Ion Torrent之所以快且便宜在于检测技术另外两个不同。
HiSeq/MiSeq和Solid都是根据每加一个（Solid是加两个）碱基->释放荧光->照相->读取该位置的荧光信息




而Ion Torrent根据的是PCR反应时，每加上一个碱基会释放一个H离子，导致pH变化；因此Ion Torrent采用半导体（semiconductor）技术读取pH变化来辨别序列信息



补充一个网上找的表格:
价格什么的和我了解的（美西）差不多：Ion Torrent大概200~300K，HiSeq 600~750K（根据地区，购买时间，和sales rep熟不熟而浮动）
而且不考虑library制备时间的话，Ion Torrent一个run是8小时，HiSeq一个run是27小时（HiSeq还分fast run和普通run，基本是3到5天完成一个flowcell）
但是呢
1. Ion Torrent很多参数是预计值，如果没记错的话刚开始他们是说今年年末芯片的通量会达到120Gb，现在变成60Gb了，所以。。。
2. 准确率这个实在很难说，个人经验是至少对于HiSeq来说100bp（其实70bp左右就下降了）以上就不大能有99%了


这张表格就可以看出Ion Torrent可以达到测一个人类基因组1000刀（提取DNA，建library另算）。人类基因组3Gb，个人测序经验（还是HiSeq来的，而且是RNA-seq，参考性堪忧。。。）一般70~80%的reads是可比对到refseq；所以呢把错误率（accuracy），可比对性（mappability）都算上的话20X的测序深度（depth）还是有的，这个深度对基因组测序来说可以接受了
最后的最后：
Ion Torrent的发明人Jonathan M. Rothberg（同时也是454的发明人，不过已经离开Life Tech）带领的团队也参加了Genomics X Prize， "the first Team that can build a whole human genome sequencing device and use it to sequence 100 human genomes within 30 days or less, with an accuracy of no more than one error in every 1,000,000 bases sequenced, with an accuracy rate of at least 98% of the genome, and at a recurring cost of no more than $1,000 (US) per genome."
在30天内，以不超过1000刀一个基因组的价格测100个人（组委会选了100个100岁以上的老人，这是找长寿基因的节奏吧）；对于98%以上的序列，错误率不超过1/1,000,000。
Illumina木有参加这个比赛哦
参考资料：
Illumina：
http://res.illumina.com/documents/products/techspotlights/techspotlight_sequencing.pdfLife Tech：
Semiconductor Sequencing Technology
cost summary：
The Ion Torrent Proton compared to the HiSeq 2500
Archon X Prize：Archon X Prize

检验医师

现在时髦的 nextGen sequencing 技朮，在 wiki 上一查，有十数个。这面提的这个是第 6 个：http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing#Ion_semiconductor_sequencing
看了官网介绍：http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Sequencing/Semiconductor-Sequencing/Semiconductor-Sequencing-Technology/Ion-Torrent-Technology-How-Does-It-Work.html
基本概念还是挺清楚的。用加入一个新 nucleotide 时的 ph 值变化来测，而不是 ligate，扫描照相，切割这样的复杂过程，据说速度就快了。
质量不清楚。要从独立机构把不同技术作比对才知道。
我对现在的片子是否能把人的全部基因组扫过，是否有足够的 coverage 还有怀疑。不过，这个，理论上只是时间问题。