超多重分子POCT及其应用前景

奋斗的小鸟

1、超多重分子POCT的定义

分子POCT是指在密闭的卡盒中实现了样本的裂解，核酸的纯化，以及QPCR扩增全流程的分子POCT平台。这样的分子POCT平台能够实现样本进结果出（“smaple-to-answer”），并且全流程全密闭。全密闭也使得这个检测平台能彻底避免气溶胶污染的现象，又叠加全自动，从而使得产品理论上能摆脱对于PCR实验室和专业操作人员的依赖，做到下沉至没有PCR实验室的中小型医疗机构、大型医院的门急诊以及一线临床科室。

这里面，笔者在之前的文章也写到过，好的分子POCT平台一般都是基于全提取（过柱法全提取或者磁珠法全提取）和QPCR扩增来实现的。典型代表就是赛沛的GeneXpert以及Biofire的FilmArray。基于一步法（直扩法）以及恒温扩增（LAMP、RPA、NEAR等）分子POCT平台可能在某些场景下有自己的优势，但是基本成为不了主流。这主要是因为一步法提取会降低检测的灵敏度，同时，有些复杂样本类型，比如粪便、血液等，该方法并不适用。而对于恒温扩增而言，其综合检测灵敏度/特异性多少都会弱于QPCR技术。

今天我们主要来聊聊以FilmArray为代表的超多重分子POCT以及其应用前景。




那什么样的分子POCT产品能被称之为超多重分子POCT呢？

FilmArray提出的产品理念是syndromic infectious disease tests——症候群感染类疾病测试。那什么是症候群测试？Biofire官网给出的解释是：症状 + 体征 = 症候群，症状是患者显而易见的特征，例如喉咙痛，体征是疾病的可测量指示，例如温度为 102 华氏度。症候群是一组特征性地同时发生的体征和症状。

BioFire® FilmArray® 系统可进行症候群多重 PCR 测试，能同时检测与特定症候群相关的最常见病原体和抗生素耐药基因。一个患者，一类症状，通过一个测试卡就能够快速定位出引发感染的病原体类型以及是否具有一些抗生素耐药基因。在这里，笔者就把超多重分子POCT定义为能实现症候群感染类疾病检测的分子POCT产品。

从症候群感染类疾病检测这个应用场景倒推回去，考虑到肺炎、血流感染、脑膜炎等临床应用场景，那么超多重分子POCT的检测重数能力应该不小于20重。具体也要看应用场景。但笼统来说，如果分子POCT平台检测能力小于20重，对于肺炎/脓毒血症等危急重症感染的患者而言，检出率可能就不够高，就无法真正的解决临床需求。
2、超多重分子POCT的技术实现


超多重分子POCT平台又是来如何拓展自己的检测指标数呢？目前来看，有两条路径。

第一条是依托于微流控技术来实现多腔室扩增。国外后期出现的绝大多数分子POCT平台均是基于此技术路线来实现检测重数的扩展。最典型的产品莫过于FilmArray，其检测卡盒上有100多个PCR扩增腔，结合使用基于SYBR Green染料法的QPCR，理论上每一个扩增腔都可以检测一个靶标。此外，2018年被凯杰收购的QIAstat-DX公司的Diagcore产品，其卡盒上拥有8个QPCR扩增腔，结合使用基于Taqman 探针法的QPCR，配合6路荧光通道，单个卡盒一次最多可以检测48个指标。

这种技术路线的优势在于，试剂和仪器实现难度低，检测性能也更容易得到保证。如果微流控芯片上有8个扩增腔，单个扩增腔上做个4重，就能理论上最多做到单样本32个指标的检测（不考虑内部质控）。单管4重，对于试剂开发而言，难度就没有那么高，且试剂检测性能也能很容易达到传统的QPCR试剂同等水平。而对于仪器开发而言，四路荧光通道，保证荧光通道之间不会因为串扰而引起假阳性，这也不是一件特别难的事儿。拥有类似这种多腔室分子POCT产品的公司还有Biocartis（2018年与万孚组建中国合资公司），Genmark Diagnostics（2021年被罗氏收购）等。

第二条路径是依托于熔解曲线实现单管多重。国内的公司都是基于此技术路线开发检测试剂盒，当下还没有分子POCT产品。基于这个技术路线实现多重检测会面临着五大问题：1、单管扩增重数太多，会面临竞争抑制，从而影响检测的性能。所以选择这种技术路线，会面临着在扩增重数和试剂的灵敏度之间进行取舍的问题。2、单管扩增的重数太多，会引发引物、探针、目的序列等的非特异性结合，这可能会导致测试出现假阳性。所以选择这种技术路线，会面临着在扩增重数和试剂的特异性之间进行取舍。3、基于问题1和2，基于熔解曲线的单管多重一般也不会超过15重，而且检测性能也很难达到传统QPCR试剂同等的水平。4、熔解曲线技术路线需要仪器尽可能的支持多的荧光检测通道，此外，其对于仪器的控温精度也提出了更高的要求。5、该技术路线在PCR扩增之后又增加了熔解曲线分析这一步骤，让整个核酸检测的时间变得更长。

所以，就笔者所知，当下并没有哪个特别成熟的分子POCT平台采用熔解曲线来实现检测靶标数的扩展（注：FilmArray的熔解曲线更多的是增加特异性，多重是靠多扩增腔实现的）。从这些角度上讲，笔者也更推崇基于多腔室扩增实现的超多重的分子POCT平台。
3、从FilmArray来看超多重分子POCT的临床应用前景

我们不妨先来看看FilmArray的具体应用场景。
FilmArray的检测菜单分为6个大类：呼吸道感染22联检；血液感染43联检；消化道感染22联检；脑膜炎/脑炎14联检；肺炎33联检；关节感染39联检。其主要解决的是危急重症感染对于快速病原体诊断的需求。FilmArray通过多腔室超多重检测的设计，能有效提高危急重症感染的病原体检出率，缩短病原体检出时间，从而缩短患者ICU住院天数，有效减少了抗生素的滥用。在某些情况下，甚至能挽救患者的生命。
以下两张图均来自Biofire FilmArray的官网。


FilmArray 呼吸道感染检测卡盒已被证明可显著减少 ICU入住天数和抗生素使用时间：使用FilmArray呼吸道感染卡盒检测之后，呼吸科ICU患者平均住院天数从9.2天缩短到了6.2天，抗生素使用天数也从3.2天缩短为2.7天。


使用FimArray血培养检测卡盒测试之后，结合抗生素管理，能为每位住院患者节省超过3000美元的费用。
4、危急重症感染：超多重分子POCT VS. mNGS/tNGS

国内危急重症感染当前还没有很好的解决方案。
在这个领域，mNGS和tNGS虽然也在致力于解决问题，但其高昂的检测费用以及动则12小时以上的TAT时间，并没有真正解决临床痛点。作为对比，类似于FilmArray的这种超多重分子POCT平台，其检测项目普遍检测时间约为1小时。这个检测时效性决定了其在危急重症感染领域具有不可替代的优势。
理想情况是，危急重症感染先使用FilmArray这种超多重的分子POCT产品进行检测，如果没有检出，再考虑使用tNGS和mNGS检测。而单次检测20-30个指标的FilmArray这种超多重分子POCT产品在实际的临床应用场景中，也确实能解决绝大部分病人的问题。这样子，在危急重症感染领域，超多重分子POCT作为一线检测手段将被广泛使用，而tNGS和mNGS则在超多重分子POCT检不出的时候作为终极手段压轴出场。我们也可以看看国家器审中心在2022年9月29日发布的《当前关于病原体宏基因组高通量测序产品的几点考虑》中的说法：
“基于mNGS技术的产品与常规的病原体检测产品相比，具有检测过程较为复杂、易受到人源基因的干扰、检测时间较长、结果解读专业要求高、检测成本高等特点，一般用于传统检验方法未能给出明确病原学结果从而影响患者准确诊疗的感染性疾病、新发突发传染病、危急重症或排除其他发热疾病。推荐临床通过拟诊先行传统微生物检验及常规分子生物学产品检测常见病原体，不盲目使用mNGS技术。在必要或紧急情况下，如危急重症、群体性感染事件等，可考虑与常规方法同步进行检测。”
基本的思路也是非必要不使用mNGS技术。
此外，超多重分子POCT注册报证难也是相对的，相对于tNGS和mNGS而言，其注册路径清晰得多。如果多重分子POCT产品能取得注册证，这就彻底解决了国内危急重症感染检测的合规性问题，这也是tNGS/mNGS当下无法入院的首要障碍。
笔者把多重分子POCT、多重PCR试剂、tNGS/mNGS三种检测手段在危急重症感染领域中在检测即时性、对操作人员要求、检测耗材成本、检测平台成本四个维度上进行了对比。整体而言，多重分子POCT在检测时效性上具有无可比拟的优势，在检测操作的便利性上也具有非常大的优势。此外，如果产品设计合理，其检测耗材成本也能逼近多重PCR试剂的成本。


FilmArray在欧美市场已经证明了这个平台的前景，那国内的超多重分子POCT平台前景如何，让我们拭目以待。

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