干货分享 | 如何设计各类PCR实验引物（PCR、qPCR、RT-qPCR、ChIP-qPCR、MeRIP-qPCR）

病理医师

在分子生物学研究中，聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一项基础且关键的技术，广泛应用于DNA克隆、基因表达分析、病原体检测等多个领域。引物作为PCR反应的核心组成部分，其设计质量直接影响到实验的成败。本文将详细介绍常规PCR、实时荧光定量PCR（qPCR）、实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）以及ChIP-qPCR和MeRIP-qPCR的引物设计原则和流程。
一、常规PCR
PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其中引物的好坏与PCR结果有密切关系。PCR不仅要求引物与靶DNA特异结合，还要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸（图1）。



图1 PCR实验原理

◆  引物设计要遵循以下原则   ◆
01.引物长度一般在15-30bp；
02.引物GC含量一般为40%-60%；
03.引物所对应的模板序列的Tm值最好在50-65℃左右；
04.引物3’端不可修饰，而且避免出现3个以上的连续碱基、互补、二聚体或发夹结构；
05.引物5’端可以修饰；
06.碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

• 接下来介绍利用NCBI和Primer Premier设计引物，以Hoxc9基因为例：
  

（1）打开NCBI网站，选择Gene一项，搜索Hoxc9基因。


（2）根据搜索结果，查找并选择目标基因所在的种属。


（3）在Genomic regions, transcripts, and products一项中点击FASTA格式，复制完整的碱基序列（不包含行号和其他字符）。


（4）打开Primer Premier软件，粘贴已复制的碱基序列。




Primer Premier的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计（Primer），限制酶切点分析（Enzyme），基元查找（Motif）。
（5）点击Primer，进行一下参数设置。






（6）点击Edit Primers 对该引物进行编辑，上游引物从3’端进行碱基的删除调整，下游引物也从3’端进行碱基的删除调整，尽量不出现红色found为宜。
（7）最后将选定的引物在NCBI进行特异性BLAST，再进行合成。
二、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
实时荧光定量PCR，即第二代PCR，在聚合酶链反应“变性-退火-延伸”扩增过程的“延伸”段，对荧光探针标记的靶基因荧光信号进行实时采集，通过3个参数（荧光信号-Ct值-靶基因的起始浓度）间的关系，最终确定靶基因的拷贝数或基因的表达水平。qPCR常用的方法主要有两种：TaqMan探针法和SYBR Green法（图2）。此技术主要用于DNA或cDNA的定量分析，如基因表达分析、病毒载量检测等。



图2 SYBR Green法实验原理

qPCR引物设计流程与普通PCR一致，但相较于普通PCR的引物设计原则，qPCR更为严格，具体如下：1. 引物的退火温度要高，一般要在60℃以上；2. 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；
3. 对于定量PCR来说，特别是在使用SYBR Green的情况下，引物二聚体的存在对结果的干扰较大，所以在选择引物时要尽量避免容易形成二聚体的引物。

三、实时荧光定量逆转录PCR(Real-time RT-PCR, RT-qPCR)
逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）是一种结合了逆转录PCR和实时荧光定量PCR的技术，可以对RNA分子进行定量分析。RT-qPCR先通过反转录酶将RNA逆转录成cDNA，然后利用qPCR技术对cDNA进行定量分析。RT-qPCR技术广泛应用于RNA表达水平的研究，如基因表达分析、病毒载量检测等。
RNA的荧光定量PCR引物要求与普通qPCR相同，但要特别注意因为扩增的序列为RNA反转录后的cDNA，因此扩增的序列不能包含内含子，只能设计在外显子上，因为成熟mRNA的内含子是被剪切掉的。
四、ChIP-qPCR
染色质免疫沉淀（ChIP）是通过特异性抗体识别和结合目标蛋白，共沉淀出与其互作的DNA，从而检测目标蛋白互作的靶基因的技术（图3）。



图3 ChIP实验流程

ChIP-qPCR的实验目的不仅包含检测 ChIP 实验是否成功，为后续的建库和测序做准备，还包括检测蛋白与目标区域 DNA 的结合。一般情况下，可以根据已发表文献的ChIP-seq数据，来获取目标区域的引物信息，但当文献中查不到所需要的引物时，我们可以根据目标蛋白结合的靶基因的区域进行设计，比如转录因子通常在启动子区域结合，我们可以在靶基因的启动子区进行引物设计。通常认为基因转录起始位点上游2kb属于基因的启动子区。不过为了保险起见，也可以在多个位置设计引物进行检测。

• 以Hoxc9基因为例，该基因启动子区域碱基序列查询如下：
  

（1）点击Genomic regions, transcripts, and products一项中FASTA，查看右边Change region shown一栏。


（2）注意转录方向，输入基因转录起始位点上游2000bp区域，点击Update View，得到的序列为基因的启动子区域，后续按照普通qPCR引物设计原则设计引物即可。


五、MeRIP-qPCR
RNA甲基化免疫共沉淀技术(methylated RNA immunoprecipitation，MeRIP )是利用免疫共沉淀的方法即用抗RNA甲基化抗体与被随机打断的RNA片段进行孵育，下拉得到有RNA甲基化修饰的片段，检测全基因组的RNA甲基化的修饰的技术（图4）。



图4 MeRIP-seq实验流程

与普通的qPCR有所不同，MeRIP-qPCR是验证某个目标基因上的某个修饰位点（以一小段区域的形式，MeRIP法精确不到单碱基）的修饰水平。得到的结果往往是一个%(IP/Input)的数值，它体现的是该位点的修饰水平（目标基因发生该修饰的转录本占该基因总转录本的比例），而普通qPCR验证的是某个基因的表达水平（共表达了多少转录本）。
根据研究目的，要求引物不仅针对目标基因，还要针对该基因的修饰位点。引物设计原则以motif为中心设计引物，PCR的产物包含m6A motif，大小在100-200bp左右，而修饰位点的信息可以从MeRIP-seq数据中获取或者从专业预测网站如m6A RNA甲基化预测网站SRAMP中得到。
若从富集产物的测序结果中已获得修饰序列的信息，想通过RT-qPCR进行下步验证，可直接按照正常的引物设计原则扩增目的序列即可。

• 现对甲基化峰区域的基因序列的查找进行介绍：
  

（1）打开UCSC网站，选择Genomes-other，点击所属的种属。




（2）在Position/Search Term中填写MeRIP-seq结果中甲基化峰所在的染色质的位置，点击GO。


（3）点击View-DNA Sequence，随后点击Get DNA，可得到该甲基化峰的基因序列。后续按照RT-qPCR引物设计原则设计引物。






至此，我们已经详细探讨了不同类型的PCR技术中引物设计的要点和步骤。希望能为大家提供实用的信息和指导，帮助大家在实验中设计出高效、特异性强的引物。当然，在实际操作中，可能需要根据实验的具体需求和条件进行调整。
如有相关技术需求，欢迎联系我们。最后，祝大家科研顺利，发文就发CNS~



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