免疫荧光染色注意事项 | 附零失误封片技巧

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石蜡切片脱片常见原因

• 展片不充分：展片不充分、捞片时有气泡、切片有皱褶没展平等原因造成附贴不牢或附贴时切片下气泡过多。（脱蜡后肉眼可见有皱褶，说明展片不充分，皱褶部分样品容易脱片！！）
  
• 脱水程序设置不合理：脱水过程中无水乙醇和二甲苯时间过长;
  
• 技术操作问题：复水及PBST清洗过程尽量用泡的，不要冲
  
• 抗原修复：用EDTA修复比柠檬酸容易脱片
  
• 用高温修复时，温度骤冷也可能引起。用含有多聚赖氨酸的玻片有助于粘附
  

避免自发荧光

1、严格去除切片上的石蜡残留
所有石蜡切片在染色前都需要通过二甲苯去除石蜡。建议将这一步的时间延长至平时的一倍，即二甲苯①、二甲苯②、二甲苯③可各停留30min。脱蜡记得烤片1h左右，提高脱蜡效率，也可使组织与玻片贴的更紧。
2、血清封闭
一般采用动物血清，在室温下封闭1h左右。建议适当延长封闭的时间至2h。如果室温较低，可以考虑采用37℃孵育箱进行封闭，优化封闭时间，充分去除组织中的类属抗原。
封闭时使用的血清尽量采用高质量的国外产品。若血清质量不好，里面可能含有纤维蛋白原(正常血清是不含有纤维蛋白原的)，一旦沾到组织上，基本洗不掉了，也会增强自发荧光信号。此外，低质量的血清还包含有很多其它杂质。
3、抗体浓度
一抗的浓度需要预实验摸索，最好采用“棋盘法”进行浓度梯度预试。一抗浓度过高(本身荧光实验，一抗的浓度就较高)，也是造成自发荧光强的重要原因。
荧光二抗
采用进口的荧光二抗是非常重要的。因为低质量的荧光二抗中往往残留较多的未标记游离荧光素，游离的荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，它们的自发荧光也是很强的。

• PS. 二抗在4℃长时间放置后可能有部分荧光素沉淀，导致染色结果有星星点点的杂质，损失珍贵样本！建议配成工作液后，高速离心，取上清使用
  

4、阴性对照
每次实验准备只染二抗、和不表达目标蛋白的阴性对照
抗原修复  

• pH值的应用范围及选择
  

      应用于抗原修复的物质很多，但至今为止，大家公认的最好的抗原修复液还是柠檬酸盐缓冲液pH6.0，据多年来的实践认为，该液确实很好，它适合于大多数的抗原，在常规应用的临床标记抗体中基本都适用，经用该液修复后的抗原表达增强，抗原的定性和定位很理想，结果不错。但近来也有文献报道，应用抗原修复液pH8.0的效果也不错  
2. 抗原修复时应选择最佳温度
      据Masson等研究表明：70℃～90℃的温度对没有经固定的蛋白可发生变性，但经福尔马林固定的蛋白，要使其发生变性，温度必须在92℃以上。据实验认为温度在92℃～98℃之间，尤其在95℃最为合适，这是因为：①这种温度未达到沸腾，切片不容易脱离载片；②能够解离和破坏与蛋白交联的甲醛醛键等，处理时可以随意选择和确定抗原修复的作用时间。
      抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的
      抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其自然冷却，决不能为了争取时间，强行用冰块或冷水使其冷却。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。如果用冰块和冷水强行使其降温，松开后的蛋白分子肽链突遇降温而固定下来，恢复不了原有的构型，达不到预想的效果。
3. 使用足量的抗原修复液
      抗原修复的方法都采用加热的方法，尤其是微波辐射加热法，该法由于产热快。液体容易挥发直至干涸。因此，应用于抗原修复的液体，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修复的切片，如果由于液体少而导致切片的干涸，则应丢弃切片，因为热干涸的切片中的抗原是没办法补救的，因它是一种不可逆的现象。据实验认为，用于微波辐射抗原修复的液体，量大可多至1000ml。应用大量的抗原修复液时，由于它的量较大，可延缓了液体的沸腾时间，增加了切片受微波辐射的量，对抗原修复将达到彻底。
      在实际工作中，并非所有的抗原都要进行抗原修复，抗原性保存良好或基本保存者不需要修复，同时应根据抗原种类予以选择修复方法，必要时可多种复原方法同时使用，以其获得更理想的结果。
零失误 封片保存技巧

    最后一步封片也很重要。组化笔不要圈的太小！封片剂会弥散不开！ 采集不到样品信号！封片剂也不宜添加过多，可用10ul枪头吸取少量，点在每个样品边缘，缓慢盖片。

• 用10ul枪头滴加~5ul/样品（根据组化笔大小 酌情更改封片剂滴加量） 千万不可打出气泡！不要把枪头最后一滴封片剂打出！气泡会严重影响封片效果！
  
• 如果不小心产生气泡  → 可以用镊子轻轻将气泡挤出（像手机贴膜一样）
  
• 如果严重封片失误 → 快速将样品泡在PBST里 → 将盖玻片取下 → 重新封片
  

组化笔圈太小！封片剂无法均匀铺展

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