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目前市场上还没有哪一种方法可以涵盖所有的检测优点, 所以甚至是传统的检测也有其市场价值, 但是就POCT的需求来说, real-time data analysis, portable, label-free, low cost以及兼顾降低人员操作的风险是大家追求的目标. 生物纳米孔在 DNA测序方面确有其比较优势(尤其是长读长以及微量检测,但请切记测序只是检出病源的一种方法), 但为了克服能上制程的问题(特别是基于摩尔定律及单位测序成本下降的比较), 所以有了固态纳米测序的方法(也是为了能更好地利用CMOS)在未来十年内医疗设备的运用(特别是POCT), CMOS的相关应用难出其右.
MEMS+CMOS满足了很多检验设备上的应用需求. 但是在攻克癌症及病原体未知领域的这块, Nanopore成为年轻医生及生化学家争相投入的新显学自有其道理.目前处在一个补充传统检测(化学, 免疫光学)的阶段. 如果完全朝向成熟的技术发展, 势必需有通路及资金上的优势(我用”资金”而非”资本”, 因为牵涉到中间商的利差及对检验试剂市场的操纵), 如果完全朝向新技术的开发, 必须有富爸爸及烧人烧芯片的准备;
单分子DNA最大的应用是遗传罕见病, NIPT; 单分子反转录在这次的新冠肺炎检测金标准上大放异彩; 伴随诊断及病原体检测则是用到了NGS及三代测序以后的市场突出了应用优势. 由于存在这样的多元性, 所以还没有一种制程可以满足所有设备的需要. 而这些新技术带来的不是更多的答案, 是更巨量的数据需要分析(AI, 大数据, 也就是烧运算资源); 任何科研在进入临床广为运用上要面临更长的磨合期, 引发更多需要实时分析数据的需求, 这正是Nanopore异军崛起最大的支持因素, 因为把复杂的, 需要高度集中化的分子检测技术带到了第一线. 但是从经济上说, 还没有进入赚大钱的资金回圈, 因为生态还没有完全建立, 到底是烧芯片还是烧运算资源, 这是属于科研的想法, 但降低临床总成本打破数量与金额的平衡赚钱, 是所有设备商与监管单位在公共卫生需求上博弈的重点.
单分子目前最擅长的市场, 仍然是科研, 科研市场是面子, 临床市场才是里子, 要吗把钱砸在实验室, 要吗砸在申请临床认证, 但是我们的终极客户仍然是医生, 而真正付钱的是保险公司. 短期内这生态不容易改变.
纳米孔检测第一要解决的问题, 就是单链DNA通过纳米孔的速度控制; 目前市场上可用的固态纳米孔通过速度>10nt/μs, 而生物纳米孔是1nt/μs, 意思就是Signal bandwidth必须大于1 MHz来取得可读取的分辨率, 但是这大部分的商用amplifier是做不到的; 2.在bandwidth增加的时后背景去噪是一个大问题. 目前普遍看到的解决方法是用”酶”. 大约可以降低到2.5–70nt/sec.
其次是如何达到高信号/噪声比, 去背景噪讯会考虑使用PDMS材质(如同微流芯片)或光阻剂降低暴露在电解液中的区域, 在纳米孔膜下方插入一层氧化物, 或寻求硅材质的取代物作为基质.
另外, 孔膜的厚度会影响感测区, 这是石墨烯材质会被客户提出来的原因之一,以上都会增加额外的制作成本;
纳米孔技术在商用上确实有以下的缺点:
1.纳米孔径大小会随着使用时间而逐渐变大;
2.纳米孔对于检测物不特定的吸收也会造成检测结果的变异;
3.即便所有的参数都控制在高度一致, 但不同的纳米孔仍然缺乏比较基础;
4.就是在大量生产需要的标准化还是不容易达到
至于近几年火热的mNGS(病原体宏基因组测序)市场, 有不少测序公司抱持一种看法, 就是病原NGS的POCT只有一种可能,把病原富集技术结合纳米孔测序。但我的看法是, 去人源背景的技术虽然很关键, 但也很可能在过程中把有用的微量病原体也给滤掉了, 此外就是在可比性/可重复性上, 不同取样方式, 保存方式, 核酸提取, 测序平台都有可能存在不同的错误偏好; 造成假阳性结果。这类的富集技术靶向捕获是主流, 这是由于成本和产能的限制导致测序深度与广度不能兼得下, 提高均一性跟覆盖度的方法, 纳米孔测序的优势在于超长读长, 对基因组DNA还能保留甲基化修饰信息. 但目前很建库仍基于PCR(多重PCR扩增)方法, 所以有越来越多研究应用CRISPR-Cas对目的区域剪切后进行富集, 然后再通过纳米孔测序. 但是在DNA的纯化, 建库过程中, 长链断裂是无可避免的, 还有 Cas蛋白拖靶的问题. |
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