质谱：工作原理、仪器类型和质谱数据分析

Rose

我们今天所熟知的质谱（Mass Spectrometry，MS）是三位优秀的科学家发明的–Wilhelm Wien，JJThomson和Francis Aston的开创性工作使得这项技术有了质的飞跃的结果。如果要选择一个标志性的出版物来表示MS的诞生，那么通常会考虑Thomson在1907年发表的论文《论正电》，当然还有许多值得关注的文章。MS的历史本身就是一个有趣的故事，有兴趣的读者可以参考Griffiths的《质谱学简史》 和Munzenberg的《从汤姆森和阿斯顿发展到现在的质谱仪》两本著作以进一步阅读和了解。



从早期开始，MS就从一些重大的技术进步中受益。如今，MS在日常生活的许多方面都发挥着作用。当我们去看医生并抽取体液进行测试时，其中许多将由MS进行分析。构成我们所有电子设备基础的半导体都使用MS作为质量控制过程的一部分。通过使用MS帮助我们保证航天安全，以帮助在爆炸危险性爆炸物登上飞机之前对其进行识别，还可以帮助寻找食物中的毒素。MS应用几乎是无止境的。
什么是质谱，质谱如何工作？
MS是一种化学分析形式，用于测量样品中原子或分子的质荷比（m/z）。它还能区分同一元素的同位素。根据质谱仪的类型，这些测量通常可用于确定样品组分的确切分子量并鉴定未知化合物组成。
质谱仪有许多不同的类型，但是它们共有三个共同的特征（如下图1）。第一种是可以使样品中的原子或分子离子化的方法。质谱仪中使用的电场无法控制中性物质，因此有必要产生离子。有许多不同的方法可以完成此操作，这些方法统称为离子源。



图1：MS的主要步骤概述以及每个步骤可用的常见类型。

所有质谱仪的第二个组件是质量分析仪。有几种不同的方法可以测量离子的m/z比。飞行时间（ToF），磁区和四极质量分析仪是最常见的分析仪，每种分析仪都有其自身的优点和局限性。
所有质谱仪系统共有的最终组件是一种检测或计数特定m/z值离子数的方法。这些设备被称为探测器，它们也有几种不同的形式，最常见的是电子倍增器、法拉第杯、通道加速器和通道板。同样，每种仪器都有其自身的优点和缺点。
需要考虑的最后一个因素是如何将离子源耦合到样品上以产生用于测量的离子，尤其是考虑到所有质谱仪必须在真空下运行这一事实。在某些情况下，样品也将被置于真空中，在其他情况下，样品将处于大气压下（通常称为环境MS技术），并且某些样品可能在引入电离室之前采用其他形式的分离技术。以下各节将更详细地介绍质谱仪的这三个常见的组成部分。
质谱仪的离子源
电离对于任何质谱分析都是必不可少的，为此，不同的方法适合不同的样品类型和应用。可以将它们大致分为气相法、解吸法和喷雾法。下面给出了每个方法的概述。
气相法
1、电子电离（Electron Ionization，EI）
分析物分子必须处于气相中，才能与加热的灯丝在真空中产生的高能电子发生有效相互作用。EI可以被认为是使分子破碎和离子化的一种相当苛刻的方法，当样品相对易挥发且分子量较低时，常使用EI。
2、化学电离（Chemical Ionization，CI）
气体以高于分析物的浓度引入EI电离室。载气与电子的相互作用将产生几个分子离子，随后它们将与过量的载气进一步反应并形成不同的分子离子。然后，这些离子将通过几种不同的机制与分析物分子发生反应，从而形成分析物分子离子。CI是一种非常柔软的电离技术，不会导致广泛的碎片化。
3、实时直接分析（(Direct Analysis in Real Time，DART）
创建等离子体，产生离子，电子和激发态物质。然后，激发态物质与液相，固相或气相样品的相互作用导致分析物分子的电离。DART无需事先准备样品就可以在环境条件下分析不同形状和大小的材料。
4、电感耦合等离子体（Inductively Coupled Plasma，ICP）
含有待分析物的制备液体被雾化并使用等离子体转化为气相离子。ICP能够电离几乎所有元素。
解吸方法
1、基质辅助激光解吸电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）
由要检测的分子类型决定的“基质”，过量添加到要分析的样品中。然后用激光照射样品，使分析物分子气化，几乎没有碎片或分解。可以产生带正电和带负电的离子。MALDI是主要的“软”电离方法之一，特别适用于分析大分子或不稳定分子。
2、快速原子轰击（Fast atom bombardment，FAB）
一束加速离子化的原子聚焦在要分析的样品上，喷射并电离目标分析物。这是一种软电离技术，能够产生带正电和带负电的离子。
3、热电离源
产生正离子的加热的Cs是最常见的一次离子源，可通过静电离子光学系统聚焦于二次离子MS。
4、等离子体电离源
通常用于产生气态离子束，将电子发射到通常为纯氧的气体中，使其电离并产生等离子体。离子然后可以通过电荷过滤并加速成束。
5、液态金属离子源（Liquid Metal Ion Source，LMIS）
离子源是低熔点金属，通常为Ga，通过施加热量和电场在小点源产生离子。LIMS产生的离子束的特点是光斑尺寸最小，亮度最高，特别适合需要高空间分辨率的MS成像。
喷雾方法
1、电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI）
通过溶剂蒸发减小带电液滴的大小，直到喷射出气相离子为止。这种软电离技术适用于大分子与大分子的分析。
2、解吸电喷雾电离（ Desorption Electrospray Ionization，DESI）
与ESI非常相似，不同之处在于ESI源中形成的带电液滴被引导至保持在环境压力下的样品。然后，反射的液滴会携带解吸和离子化的样品。
质量分析仪的类型
样品电离后，必须将离子分离，这会在质量分析器中发生。常用的质量分析仪包括：
1、飞行时间（ToF）
离子根据其m/z比率进行分离，该比率基于它们穿过已知长度的飞行管到达检测器所花费的时间长度。
2、四极杆

进入四极杆的离子的轨迹被电势偏转，其方式与其m/z值成比例。改变电势仅允许特定m/z值的离子到达腔室末端并被检测到。
2、磁场
磁场按照离子的m/z比将离子分散在轨迹中，其方式类似于玻璃棱镜将光分散为各种波长或颜色的方式。
3、离子阱
类似于四极杆，但电极呈环形，并且通过将不稳定振荡的离子从系统中排放到检测器中，而不是检测稳定振荡的离子，从而分离并检测离子。
4、Orbitrap质谱
许多其他类型的质量分析器的借用技术。两个电绝缘的杯状外部电极与心轴状的中心电极相对，该中心电极周围具有特定质荷比的离子扩散到轨道环中。电极的圆锥形将离子推向阱的最宽部分，然后将外部电极用于电流检测。这是这里描述的唯一使用镜像电流而不是使用某种检测设备来检测离子的方法。
5、串联质谱法（串联MS）
指涉及不止一种类型的质谱仪以提高特异性或质谱分离能力的混合方法。它们通常被称为MS/MS技术。

质谱仪的类型-质谱仪的配对电离技术
有了这么多不同类型的离子源，电离机制和不同类型的质量分析器，可以通过一些工程工作来构建许多不同的排列和系统组合。但是，有些类型的电离源和质量分析器可以很好地相互配合，它们构成了最常见的商用仪器。例如，许多激光系统的脉冲特性非常适合于ToF质量分析仪，而ToF质量分析仪需要脉冲离子源作为质量鉴别的基础。本节将更详细地介绍一些常见的离子源和质谱分析仪配对。
1、MALDI-TOF
如上所述，许多激光系统的脉冲特性以及对ToF分析的要求使得这对电离机理和质量分析非常理想地相互匹配。当激光在基质/样品点（保持真空）上发射时，离子形成并加速进入ToF飞行管中。“开始”并测量质谱。
该方法还能够通过逐步扫描台架，在重复发射激光下连续扫描台架或通过扫描激光束来生成图像。生成的图像可以提供有关样本的大量信息，例如大的组织切片。
由于MALDI是一种软电离技术，因此可以保留分子信息，并且不需要像荧光显微镜那样标记感兴趣的化合物进行检测。因此，它提供了“无标签”成像的方法。
2、ICP-MS
尽管最初与四极杆质量分析仪一起使用，但大多数ICP-MS系统现在都使用ToF质量分析仪。此处最大的优势是，与使用四极杆的系统相比，整个质谱的生成速度更快且具有更高的质量分辨率。一些专用系统使用磁性扇区仪器，通常与用于高精度同位素比测量的多收集器检测系统配合使用。
此外，通过与激光束耦合以形成激光烧蚀（LA）-ICP-MS，该技术还可适用于形成由烧蚀材料的质量分析产生的图像。由于这是一种破坏性技术，材料只能被分析一次，因此具有追溯挖掘和处理ToF数据的能力是一个很大的优势。在ToF成像中，整个质谱将存储在所得图像的每个（x，y）像素位置，因此可以在分析后轻松生成新的离子图像。
3、DART-MS
由于前面提到的所有原因，DART-MS还使用了ToF质量分析器。但是，由于它是一种环境压力技术，因此注意质谱仪（真空）界面的来源（环境）非常重要。
在原始设计中，分析物离子通过一对孔被导入质量分析仪，孔之间有微小的电位差。两个孔的排列错开排列以捕获中性污染并保护高真空区域。离子通过中间的圆柱形电极被引导到第二孔，但是中性分子沿笔直的路径传播，因此被阻止进入质量分析器，并被真空泵除去。
4、二次离子质谱（SIMS）
二次离子质谱（SIMS）技术中使用的电离方法是FAB的近亲。产生带正电或带负电的离子束，但没有使用碰撞池将离子束转换为中性物质。该离子束直接用于轰击样品表面。最常用的离子是铯+和O2+用于带正电的离子束和O -为带负电荷的光束。Cs+和O离子是由前面所述的热电离和等离子体源形成的。
注意，Cs和O都是反应性物质，不是惰性的。在SIMS中，这是有意的，因为两者都会被植入样品中并影响其化学和物理特性。但是，他们影响的是他们的路径。
在直流电源中最经常观察到Cs和O光束，并且所用的高加速电压会导致样品中分子的严重断裂，从而在分析过程中不会保留任何分子信息。它们的使用将被认为是硬电离方法。
为了避免这种情况，还开发了大小簇离子（Au3+，Bi3+，C60+，Ar2+）的脉冲源，这些脉冲源被认为是更柔软的电离方法，并在结果中提供了更多的分子细节。质谱。这些源通常以脉冲模式运行，这进一步减少了对样品表面的损坏。

ToF，磁区和四极质谱仪通常在SIMS仪器中使用。
离子检测器的类型
所有MS系统的关键要素是用于将质量分离离子流转换成可测量信号的检测器类型。根据包括动态范围，空间信息保留，噪声和对质量分析仪的适用性在内的因素，使用不同类型的检测器。
常用的探测器包括：
1、电子倍增器（EM）
离散金属板的串联连接，可将离子电流放大约108到可测量的电子电流。
2、法拉第杯（FC）
碰到集电极的离子会导致电子从地面流过电阻，从而导致电阻两端的电位降被放大。
3、光电倍增电极
离子最初撞击打拿极，导致电子发射。然后产生的电子撞击荧光屏，荧光屏又释放出光子。然后，光子进入倍增器，在倍增器中以级联的方式进行放大-就像EM一样。
4、阵列检测器
包括用于同时测量不同m/z的几种离子的检测器和用于位置敏感离子检测的检测器，涵盖了多种检测器类型和系统，可以结合多种检测技术。
质谱仪与其他技术的结合
气液分离技术通常与MS结合使用，以提高灵敏度并简化解释。液相色谱（LC），气相色谱（GC），毛细管电泳（CE）和凝胶电泳（GE）是常见的示例。与ICP-MS和DART-MS结合使用时，方法的组合尤为常见。
1、气相色谱质谱法（GC-MS）
GC是一种分析/分离技术，其中将复杂的化合物混合物注入色谱柱中，并根据其相对沸点和对色谱柱的亲和力进行分离。
GC中使用的高温使其不适合用于高分子量化合物（例如蛋白质），因为它们会使热量变性。它非常适合用于石化，环境监测和修复以及工业化学领域。样品本质上可以是固体，液体或气体。
分离后，可以通过质谱技术（例如ICP-MS）分析化合物以进行鉴定，或使用EI或CI将其离子化，然后在ToF质量分析器17中进行分析。最近已对GC-MS领域的进展进行了回顾。
2、液相色谱质谱法（LC-MS）
LC与气相色谱相似，不同之处在于样品现在处于液相状态。将样品溶解在溶剂中，然后注入到色谱柱中，该色谱柱由可溶化合物（流动相）和固相（固定相）组成。
样品成分与色谱柱固定相之间的相对亲和力导致样品成分分离，然后可以通过质谱检测。由于流出物处于液相状态，因此这种分离技术非常适合与ICP-MS和ESI-MS方法结合使用，但也发现与离子阱和Orbitrap质谱仪相关。
3、交联质谱（XL-MS）
了解多蛋白复合物的结构和组织对于了解细胞功能至关重要。化学交联与质谱联用（XL-MS）是一种方法，可与诸如低温电子显微镜（cryo-EM）和X射线晶体学之类的结构生物学技术互补，但可提供较低分辨率的结构信息。
在XL-MS中，蛋白质或蛋白质复合物用交联剂处理，该交联剂会在蛋白质中的特定官能团之间引入共价键。然后将交联的蛋白质用分解该蛋白质的酶消化，并通过LC-MS方法分析所得混合物，以鉴定交联的肽并确定其序列。交叉链接的位置提供了有关正在研究的系统的结构信息。但是，解释很复杂，因为以这种方式制备的样品比非交联蛋白的消化物包含的独特化学种类要多得多。潜在的交联肽的数目随序列长度二次增加。尽管如此，XL-MS还是一个有用的工具，可帮助开发蛋白质-蛋白质相互作用的结构模型。
4、氢交换质谱（HX-MS）
氢交换质谱（HX-MS）的目标类似于XL-MS的目标–研究多蛋白复合物，尤其是蛋白结构和动力学。
HX-MS的优势包括以下事实：它可以探测溶液中蛋白质的结构，因此无需结晶；它仅需少量样品（500-1,000皮摩尔）；可以研究难以纯化的蛋白质，并且可以揭示结构和动力学随时间的变化。
HX-MS利用化学反应，使蛋白质中的某些H原子与溶液中的H原子连续交换。如果将H2O水溶液用重水（D2O）代替，则可以进行此交换过程。特别地，与氨基酸主链N原子键合的H（也称为主链酰胺H）可用于探测蛋白质结构。H与D的交换完成后，可以通过MS分析样品，以提供有关具有小分子结合，蛋白质折叠的蛋白质结构变化的信息，或有关未结晶或不适合其他结构生物学的蛋白质结构的信息方法。
5、基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）
MALDI-TOF不仅是MS分析的出色方法，而且还能够通过逐步扫描平台，在重复发射激光的情况下连续扫描平台或通过扫描激光束来生成图像。这项技术称为基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）。所得到的图像可以以50-200mm之间的空间分辨率提供有关大型组织切片的大量信息。由于MALDI是一种软电离技术，因此分子信息得以保留，因此不需要像荧光显微镜那样标记感兴趣的化合物进行检测。因此，它提供了“无标签”成像的方法。
如何解释质谱，m/z显示什么，什么是分子离子峰？
典型的质谱图如下图2所示。在这种情况下，显示了由CH3和CH2基团组成的戊烷（C5H12）的质谱图和结构。



图2：戊烷质谱。
纵轴表示在质谱仪中检测到的离子的相对强度或信号，而横轴表示其m/z比（质量除以电荷数）。因此，最强的峰将具有100的相对强度。

戊烷的化学式为C5H12。因此，该分子的近似质量为（（12 x 5）+（1 x 12））或72amu。注意，在质谱上，在m/z =72amu处观察到相对强度为〜10％的峰。这是分子峰。整个分子已在离子源中被离子化为单个实体，没有任何碎片。但是，还有哪些更强大的高峰呢？这些是戊烷电离过程中碎裂的结果。如何解释观察到的下一个最重的质量（在m/z =57amu，相对强度为20％的情况下）？通过一点数学，我们可以建议它可能是C4H9，这可能表明其中一个CH3在电离过程中，两个基团被碎裂，留下了C4H9碎片分子离子。类似地，在m/z=43amu处观察到的最强信号可以解释为C3H7，这意味着C2H5分子被片段化了。这相当于CH3和CH2基团之一。请注意，在m/z=41和42处也有很强的线条。这是由于从C3H7中去除了多余的Hs碎裂过程中的分子离子。这形成了解释质谱的基础，不仅需要了解化学原理，而且还需要了解母体分子的结构。显然，对于现有的所有有机材料而言，这可能是一项艰巨的任务。幸运的是，有可用的数据库显示了其中许多质谱的质谱数据，以帮助解释。

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