什么是荧光原位杂交（FISH）技术？

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什么是荧光原位杂交（FISH）技术？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/554315386

大力水手

荧光原位杂交（FISH）是以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，通过探针和样本DNA变性后杂交，以荧光显微镜观察杂交信号的细胞遗传学分子诊断技术。


作为近年来在临床病理检测中运用最为广泛的经典技术，FISH可用于检测基因扩增、基因缺失、基因断裂、基因融合、染色体数目异常，临床上具有指导治疗、辅助诊断、鉴别诊断和判断预后的作用。自上世纪80年代末发展以来，FISH技术表现出灵敏度高、特异性强，可在组织上原位检测，直观显示人体染色体或基因突变信息等特点，是多种基因检测项目的金标准。
●《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》提到：所有乳腺原发性浸润性癌均应进行HER2检测；
●《CSCO胃癌诊疗指南》中明确提出HER2基因或蛋白的过表达或扩增与胃癌的发生有关；
●《非小细胞肺癌融合基因检测临床实践中国专家共识(2023 版)》中提到荧光原位杂交（FISH）技术一般被认为是基因扩增和融合检测的金标准；
● 另外，FISH技术在血液肿瘤的辅助诊断得到了NCCN等国内外各大诊疗指南的认可和推荐，包括骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等多种血液肿瘤。
<hr/>武汉友芝友医疗科技股份有限公司（简称“芝友医疗”），是一家以心血管、肿瘤等重大疾病的个体化诊疗为战略方向，专门从事个体化医学诊断产品研发、生产和销售的高新技术企业。其FISH病理产品线HER2、ALK伴随诊断三类证的连续获批表明，公司成功的将快速杂交技术转化为国家权威部门认可的成熟产品，促进了芝友医疗在分子病理诊断方向上更进一步。


当然，FISH技术发展至今也逐渐积累了一些常见问题：如杂交速度慢，荧光信号弱，背景杂乱以及操作繁琐等，这些问题亟待解决！
秉承“量体裁衣、因人施治”的企业使命，芝友医疗快杂FISH产品线，从临床需求的角度出发，以“更快速”和“自动化”为产品关键词，推出了寡核苷酸探针快杂平台和开放式自动化设备平台，能够实现FISH实验2小时快速杂交和前处理步骤自动化操作，提高了FISH实验的准确性、杂交效率及可重复性，并已获得中国NMPA注册证和欧盟CE认证，产品性能优越、合规合法。
<hr/>                                                  2h杂交｜寡核苷酸探针技术

利用寡核苷酸探针技术（Oligo-FISH），摆脱了传统BAC克隆的技术限制，不仅高质量的实现了「1- 2h」快速FISH杂交实验，同时支持小区间高分辨率特异探针的定制化服务。


                                                      自动化｜FISH前处理设备平台



                                                                 关于芝友医疗

芝友医疗成立于2011年7月，以心血管、肿瘤等重大疾病的个体化诊疗为战略方向，是一家专门从事个体化医学诊断产品研发、生产和销售的高新技术企业。公司秉承“量体裁衣、因人施治”的企业使命，力争成为个体化医学领域的龙头企业，打造实现自我价值和回馈社会的卓越平台。
公司建立了ARMS荧光定量PCR、多重荧光定量PCR、荧光原位杂交FISH、循环肿瘤细胞CTC检测、化学发光等多种技术平台，自主研发生产了指导心脑血管疾病个体化用药的分子诊断产品，指导肿瘤诊疗的伴随诊断产品，荧光原位杂交产品以及循环肿瘤细胞检测产品，为精准医疗提供临床诊断依据，持续助力精准医疗高速、高质量发展。

作者 | 程念念
编辑 | 盛亚琴
校对 | 郭   妍
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继续前进

一．FISH的定义

荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用荧光信号检测探针的原位杂交技术[1]。它将荧光信号的高灵敏度、安全性及直观性和原位杂交的高特异性结合起来，通过荧光标记的核酸探针与待测样本核酸进行原位杂交。在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞和组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。FISH染色结果如图1.1所示。




图1.1 FISH染色结果[2]
二．FISH的原理

FISH分为直接法和间接法。

直接法是在已知碱基序列的核酸探针上标记荧光素，在组织切片、间期细胞及染色体标本上与靶核酸进行原位杂交。因所形成的杂交体带有荧光素。故可在荧光显微镜下直接观察。

间接法使用非荧光物质标记的核酸探针。如生物素或地高辛等标记探针，再通过亲和连接或免疫反应带入荧光物质来检测杂交体的存在。

广义上讲，FISH靶序列可以是DNA或RNA，既可以用来进行基因组层面的研究，也可以进行表达层面的研究[1]。

目前常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、得克萨斯红、罗丹明及其衍生物四甲基异硫氰酸罗丹明等[3]。
三．FISH的发展

荧光原位杂交技术是在同位素原位杂交技术的基础上发展起来的。1969年Gall和Pardue及John等分别独立建立了同位素原位杂交技术。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。1975年，Manning等人最先在溶液的分子杂交中，使用非放射性标记，通过细胞色素C将生物素与RNA分子连接起来。1977年Rudkin等发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术。1981年Bauman首次报道了采用荧光素标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术[4, 5]。

FISH技术发展至今已40多年，一直是细胞学研究的重要手段[6]。自1990年以来，FISH在方法上形成了从一种颜色到多种颜色、从中期染色体FISH到粗线染色体FISH再到纤维-FISH的发展趋势，并且随着物理、化学技术的发展与进步，免疫染色、量子点和微流控芯片等不断被引入到荧光原位杂交中，促进了荧光原位杂交技术和分子细胞遗传学的发展[7, 8]。

目前荧光原位杂交技术因其安全、准确、方便、实用等优点得到了广泛的关注及应用。
四．FISH的应用


01

荧光原位杂交技术在肿瘤诊断中的应用
肿瘤已经成为现代人类死亡的主要原因之一，肿瘤的提前确诊对治疗有着极大的帮助。过去诊断细胞样本中是否含有肿瘤细胞主要用巴氏染色法等一些细胞化学染色法。新涌现的辅助诊断技术相比过去的方法更快捷简单，荧光原位杂交技术就是其中之一[4]。




（1）血液肿瘤学
临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中在：染色体异位形成的融合基因的检测；基因缺失检测可以发现一些关键基因的缺失，有助于疾病的诊断及预后判断；使用荧光原位杂交技术可对微小残留病灶进行检测，以及进行造血干细胞移植状态的监测。

（2）实体肿瘤学
目前应用于临床的检测基因突变方法以NGS和PCR为主。与FISH相比，NGS对实验室要求高，同时存在检测周期长和检测费用高等问题；荧光PCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量，无法做到绝对定量，数字PCR的检测系统成本高，通量有限，操作繁琐，也不能在细胞水平上观察到基因突变的状态，不具备定位的功能。FISH技术可以在间期细胞核上找到DNA扩增的直接证据，而且间期细胞核所显示出的扩增DNA荧光信号的数量多少及荧光强度常与DNA扩增的水平有关。

FISH被广泛应用于乳腺癌、膀胱癌，宫颈癌，肺癌和淋巴癌等实体肿瘤的辅助诊断。目前，FISH主要集中用于对肿瘤的早期诊断、疗效检测，个体化治疗和预后判断等方面[9]。


02


荧光原位杂交技术在基因定位中的应用


基因定位是荧光原位杂交的最基础最成功的应用。利用荧光原位杂交灵敏、准确，并且可以一次检测多段基因等特点，可以确定目标基因的准确位置，确定几个基因之间的位置关系，以及基因与染色体端粒之间的关系，基因与着丝点的关系，是构建基因图谱的基本要素。目前荧光原位杂交技术被广泛地应用于基因的物理定位及基因图谱的绘制[4]。


03


荧光原位杂交技术在产前检查中的应用


产前诊断是优生优育的重要保障。染色体异常是评价重大出生缺陷性疾病的重要指标。最常见的染色体异常是染色体数目异常，可能引发死胎、流产，即使存活也会使患病儿童畸形、生长缓慢、智力低下等。利用荧光原位杂交技术可以检测染色体非整倍体的特点，采集孕妇羊水，对未培养的羊水间期细胞进行检测，确定其是否为非整倍体，对胎儿染色体异常疾病进行诊断，使产前诊断时间缩短至24～48 h。荧光原位杂交的实验技术和探针的不断改进，应用荧光原位杂交方法进行产前诊断对一些重大染色体异常引起的疾病确诊率已经达到99%，相较于传统诊断方法更快捷，能够减少孕妇等待的痛苦[4]。




五．FISH诊断的优势

FISH诊断的优势主要体现在经济安全、检测速度快、操作简便、灵敏度高和特异性强等方面。

在非小细胞肺癌治疗中，靶向治疗是非常有效的一种新的治疗方法，提高了肿瘤的治愈率。其中，表皮生长因子受体（EGFR）作为非小细胞肺癌分子靶向治疗的靶标，酪氨酸激酶抑制剂能够对EGFR基因变异的癌细胞的生长进行抑制。所以，对EGFR基因突变进行检测非常重要，可以为非小细胞肺癌的治疗方案和预后判定提供重要信息[10]。
参考文献：
[1]. 荧光原位杂交技术-百度文库
[2]. 陈正启. 全自动荧光原位杂交系统装置的研究与开发[D].武汉纺织大学,2020.DOI:10.27698/d.cnki.gwhxj.2020.000048.
[3]. http://www.360doc.com/content/14/0915/15/5514788_409659718.shtml
[4]. 张淼,陈瑛,吴忆宁等.荧光原位杂交技术的应用进展[J].哈尔滨师范大学自然科学学报,2014,30(06):90-93.
[5]. 佘尚扬.荧光原位杂交技术的研究进展和应用[J].中国现代药物应用,2011,5(14):129-131.DOI:10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2011.14.018.
[6]. 姜春秀,姚伟,张木清等.新型寡聚核苷酸荧光原位杂交：发展与应用[J].植物遗传资源学报,2023,24(02):349-356.DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.20220801001.
[7]. 何世斌,柴连琴,谭珺隽等.荧光原位杂交技术的研究进展[J].植物科学学报,2014,32(02):199-204.
[8]. 钱文丹,陈波利.荧光原位杂交技术及其应用[J].乡村科技,2018,No.193(25):51-52.DOI:10.19345/j.cnki.1674-7909.2018.25.030.
[9]. 温旺荣, 周华友主编,临床分子诊断学 第2版,广东科技出版社,2015.04,第72-75页
[10]. 侯舒倩.荧光原位杂交与免疫组化技术在非小细胞肺癌中的应用比较[J].黑龙江医学,2019,43(02):160-161+164.

卡卡

• 荧光原位杂交技术（FISH）的发展史
  

荧光原位杂交技术是在同位素原位杂交技术的基础上发展起来的。
1969年Gall和Pardue及John等分别独立建立了同位素原位杂交技术。
1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。
1975年，Manning等人最先在溶液的分子杂交中，使用非放射性标记，通过细胞色素C将生物素与RNA分子连接起来。
1977年Rudkin等发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术。
1981年Bauman首次报道了采用荧光素标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术。
FISH技术发展至今已40多年，一直是细胞学研究的重要手段。自1990年以来，FISH在方法上形成了从一种颜色到多种颜色、从中期染色体FISH到粗线染色体FISH再到纤维-FISH的发展趋势，并且随着物理、化学技术的发展与进步，免疫染色、量子点和微流控芯片等不断被引入到荧光原位杂交中，促进了荧光原位杂交技术和分子细胞遗传学的发展。目前荧光原位杂交技术因其安全、准确、方便、实用等优点得到了广泛的关注及应用。


2. 荧光原位杂交技术（FISH）的定义
荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用荧光信号检测探针的原位杂交技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性及直观性和原位杂交的高特异性结合起来，通过荧光标记的核酸探针与待测样本核酸进行原位杂交。在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞和组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。


3. 荧光原位杂交技术（FISH）的原理
利用DNA探针与目标DNA序列进行亲和性结合，并通过荧光染料标记的探针来可视化目标DNA序列的位置和数量。FISH分为直接法和间接法。直接法是在已知碱基序列的核酸探针上标记荧光素，在组织切片、间期细胞及染色体标本上与靶核酸进行原位杂交。因所形成的杂交体带有荧光素。故可在荧光显微镜下直接观察。间接法使用非荧光物质标记的核酸探针。如生物素或地高辛等标记探针，再通过亲和连接或免疫反应带入荧光物质来检测杂交体的存在。广义上讲，FISH靶序列可以是DNA或RNA，既可以用来进行基因组层面的研究，也可以进行表达层面的研究。目前常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、得克萨斯红、罗丹明及其衍生物四甲基异硫氰酸罗丹明等。
4. 荧光原位杂交技术（FISH）的步骤

• 制备探针：首先需要设计和制备与目标DNA序列互补的DNA探针。探针通常是通过合成DNA序列并标记荧光染料来制备的。
  
• 处理样本：将待检测的细胞或组织样本进行固定和裂解处理，以使DNA序列暴露在外。
  
• 杂交：将标记有荧光染料的DNA探针与样本中的DNA序列进行杂交。探针与目标DNA序列互补结合后，形成探针-目标DNA复合物。
  
• 洗涤：对样本进行洗涤，以去除未结合的探针。
  
• 可视化：利用荧光显微镜或其他荧光成像设备观察样本。荧光染料的发光信号将显示出目标DNA序列的位置和数量，从而实现对目标DNA序列的检测和定位。
  

5. 荧光原位探针制备
（1）荧光原位杂交所用的探针主要分为三类：
a. 染色体特异重复序列探针，例如 α 卫星、卫星 III类的探针，其杂交靶位常大于 1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；
b. 全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；
c. 特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。


资源链接：http://www.ifish4u.org/
（2）荧光原位杂技探针制备和应用
设计FISH探针需要考虑以下几个步骤：
1. 目标序列选择：确定您要检测的目标序列。这可以是某个基因、染色体区域或其他感兴趣的核酸序列。
2. 探针设计：根据目标序列设计FISH探针。通常使用DNA或RNA探针，其长度通常在15到30个碱基对之间。
a. 序列设计：选择与目标序列互补的序列片段作为探针的序列。确保探针的序列选择合适，能够与目标序列高度特异性地杂交。
b. 标记物选择：选择适当的荧光标记物，如荧光染料或荧光素，用于标记探针。确保所选标记物在实验条件下有较好的稳定性和亮度。
3. 探针标记：将所设计的探针进行标记，使其能够通过荧光显微镜观察。这可以通过直接标记或间接标记的方法实现。
a. 直接标记：直接将荧光染料或荧光素与探针进行共轭。这通常需要具有适当官能团的标记物和探针。
b. 间接标记：首先将标记物与探针的亲和性结合，例如使用亲和标记物如生物素和荧光素的结合，然后通过辅助试剂（如荧光素标记的亲和物）将标记物引入样品中。
4. 验证和优化：对设计的FISH探针进行验证和优化。这包括进行探针的特异性和敏感性测试，并进行相关实验条件的优化。
资源链接：荧光原位杂交（FISH）探针的制备及其应用 - 实验方法 - 丁香通
6. 荧光原位杂交技术（FISH）的应用
（1）荧光原位杂交技术在肿瘤诊断中的应用
肿瘤已经成为现代人类死亡的主要原因之一，肿瘤的提前确诊对治疗有着极大的帮助。过去诊断细胞样本中是否含有肿瘤细胞主要用巴氏染色法等一些细胞化学染色法。新涌现的辅助诊断技术相比过去的方法更快捷简单，荧光原位杂交技术就是其中之一。
a. 血液肿瘤学。临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中在：染色体异位形成的融合基因的检测；基因缺失检测可以发现一些关键基因的缺失，有助于疾病的诊断及预后判断；使用荧光原位杂交技术可对微小残留病灶进行检测，以及进行造血干细胞移植状态的监测。
b. 实体肿瘤学。目前应用于临床的检测基因突变方法以NGS和PCR为主。与FISH相比，NGS对实验室要求高，同时存在检测周期长和检测费用高等问题；荧光PCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量，无法做到绝对定量，数字PCR的检测系统成本高，通量有限，操作繁琐，也不能在细胞水平上观察到基因突变的状态，不具备定位的功能。FISH技术可以在间期细胞核上找到DNA扩增的直接证据，而且间期细胞核所显示出的扩增DNA荧光信号的数量多少及荧光强度常与DNA扩增的水平有关。
FISH被广泛应用于乳腺癌、膀胱癌，宫颈癌，肺癌和淋巴癌等实体肿瘤的辅助诊断。目前，FISH主要集中用于对肿瘤的早期诊断、疗效检测，个体化治疗和预后判断等方面。
（2）基因定位是荧光原位杂交的最基础最成功的应用。
利用荧光原位杂交灵敏、准确，并且可以一次检测多段基因等特点，可以确定目标基因的准确位置，确定几个基因之间的位置关系，以及基因与染色体端粒之间的关系，基因与着丝点的关系，是构建基因图谱的基本要素。目前荧光原位杂交技术被广泛地应用于基因的物理定位及基因图谱的绘制。
（3）荧光原位杂交技术在产前检查中的应用
产前诊断是优生优育的重要保障。染色体异常是评价重大出生缺陷性疾病的重要指标。最常见的染色体异常是染色体数目异常，可能引发死胎、流产，即使存活也会使患病儿童畸形、生长缓慢、智力低下等。利用荧光原位杂交技术可以检测染色体非整倍体的特点，采集孕妇羊水，对未培养的羊水间期细胞进行检测，确定其是否为非整倍体，对胎儿染色体异常疾病进行诊断，使产前诊断时间缩短至24～48 h。荧光原位杂交的实验技术和探针的不断改进，应用荧光原位杂交方法进行产前诊断对一些重大染色体异常引起的疾病确诊率已经达到99%，相较于传统诊断方法更快捷，能够减少孕妇等待的痛苦。

继续前进

随着现代医学发展，病理学领域中除了传统的常规病理技术以外，分子病理技术也在疾病的辅助诊断、指导治疗、预后判断等流程中发挥了越来越重要的作用。
说到分子病理技术，就要提到大名鼎鼎的“荧光原位杂交技术”。


那么，什么是荧光原位杂交技术？它的作用是什么？病理报告上面红红绿绿的点又是什么意思？
这些问题让许多人感到疑惑，今天，就让我们一起来走进病理科的荧光原位杂交技术。
一、什么是FISH？

荧光原位杂交，英文全称叫Fluorescence in situ hybridization，通常根据首字母简称FISH。
这项技术始于传统细胞遗传学同DNA技术相结合而开创的一门新学科——分子细胞遗传学技术。是二十世纪八十年代末期，在原有的放射性核酸探针原位杂交技术的基础上，发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
<hr/>二、FISH原理是啥？

荧光原位杂交技术根据碱基互补配对原则，通过变性复性使带有荧光物质的探针与目标DNA接合，最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置。
通俗来说，原理是利用荧光标记的DNA探针与要检测的DNA或者RNA上的特定区域杂交。




√ 荧光：利用荧光素标记特异性的DNA片段（探针）
√ 原位：要测定的目标原本所在的位置，通常是细胞核里面的DNA
√ 杂交：探针与目标DNA或者RNA特异性结合
<hr/>三、为什么需要做FISH?

肿瘤治疗中有一种非常重要的治疗方法：靶向治疗。目前，普遍的共识是，如果需要使用有明确作用靶点的药物，需要进行靶点检测后方可使用，不得在未做相关检查的情况下盲目用药。
此外，目前FISH技术在乳腺癌、胃癌、淋巴瘤和各类软组织肿瘤等肿瘤的辅助诊断中起着很大的作用；还能够通过检测其分子遗传学异常来预测疾病预后，并指导靶向治疗。
<hr/>四、检测报告上那些红红绿的的信号代表什么？

绿色和红色是目前FISH检测常用的探针荧光素标记颜色。


FISH的探针类型大致可分为：着丝粒探针(centromere-enumeration probes，CEP)和位点特异性探针(locus-specific identifier probes，LSI)。
LSI探针又分为计数探针和融合/分离探针，这种探针在临床上应用更为广泛。LSI的各类探针检测结果对应的则是染色体/基因的扩增、缺失、融合、断裂等。


① 计数探针是通过标记一段特异性的DNA片段，然后数信号的数量，从而判断染色体或基因状态。
由于正常人的染色体/基因是二倍体，那么正常人的检测信号就是两个。排除影响后，当信号多于两个或者少于两个，便可判断染色体或者基因发生了异常（扩增或缺失）。
② 融合/分离探针是基因有时候会在某些位置断开，运用不同颜色荧光素标记断裂点两端特异性的DNA片段，通过信号点颜色的变化判断是否发生了融合/分离。
基因没有发生重排时，探针标记的红绿信号因相隔距离太近而肉眼观察呈现黄色；如果发生断裂，则形成信号原始的颜色（单独的红或绿，或者分离的红绿信号）。此外，此类探针同样能够提示数目异常（如多倍体）。


在荧光显微镜下，通过不同颜色的荧光通道观察细胞核内不同探针标记的位置，各层通道图片叠加后就可用于判读是否发生基因变异从而出具诊断结果。
<hr/>五、FISH常见的临床应有哪些？

1.指导用药：由于某些基因变异区域正是靶向治疗的靶点，故可以选择对应的靶向药物进行治疗。如HER2基因扩增的乳腺癌患者明显受益于靶向药物赫赛汀（Herceptin）。
2.鉴别诊断：结合IDH突变，1P和19Q共缺失可用于鉴别诊断少突胶质细胞瘤。
3.预后判断：例如HER2基因扩增与乳腺癌患者预后差相关；5-15%的弥漫大B细胞淋巴瘤患者存在MYC断裂。FISH检测可以明确相关基因的具体情况，从而判断其预后。
4.辅助诊断：病理诊断时，已经做了形态学和相关免疫组化的病理检测，但是病理医生还是没有办法完全确认是否为某一肿瘤，这时候便可通过使用FISH技术中的相关探针的检测来辅助确诊。如MDM2基因扩增可用于辅助诊断高分化脂肪肉瘤，帮助诊断去分化脂肪肉瘤、高分化骨肉瘤在骨肿瘤与良性或反应性骨病变。EWSR1基因断裂可用于辅助诊断尤文肉瘤及粘液脂肪肉瘤，促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤，透明细胞肉瘤等。
六、做一个FISH需要多久才能出报告？

前处理流程
1、烤片：80℃烤片30分钟；
2、脱蜡：浸入提前37℃预热的脱蜡剂中漂洗4次，每次10分钟，共计40分钟；
3、洗片：取出玻片后室温下浸入100%乙醇中5分钟，重复一遍；
4、复水：取出玻片后分别浸入80%、75%梯度乙醇和去离子水中各3分钟；
5、通透：取出玻片后浸入煮沸的通透剂中30分钟；
6、酶消化：取出玻片后浸入预热的37℃胃蛋白酶工作液中消化10分钟左右；
7、洗片：取出玻片后浸泡于洗涤液（2×SSC）中漂洗两次，每次5分钟；
8、脱水：取出玻片后分别浸入70%、85%和100%梯度乙醇各3分钟；
9、干片：取出玻片后室温晾干即可即可进行杂交试验操作。

变性杂交
1．取出探针，室温静置5分钟，上下颠倒混匀探针后短暂离心，取10μL滴于杂交区域，立即盖上与组织大小相符的盖玻片，并用橡皮胶封边；
2．将玻片置于杂交仪上，85℃共变性5分钟，37℃杂交过夜。

洗涤和复染
1、取出杂交后的玻片，去除盖玻片上的橡皮胶，将切片浸入2×SSC中约5秒，用镊子轻轻将盖薄片揭去；
2、将切片置于37℃预热的2×SSC浸泡40分钟；
3、取出玻片浸入提前60℃预热的2×SSC 10分钟，然后浸入0.1%NP-40/2×SSC溶液中洗涤5分钟；
4、 取出浸入75%乙醇中，浸泡3分钟；
5、将10μLDAPI复染剂滴于杂交区域，立即盖上盖玻片；
6、暗处静置10min，最后使用荧光显微镜观察。


最后，一般情况下经过5-7天，可以出具FISH诊断报告。
总之，荧光原位杂交技术（FISH）具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位精确、一张玻片上可以使用多种颜色标记等优点。
FISH结果直观，不仅能应用于多种癌症肿块及肿瘤的鉴别与辅助诊断，还能指导肿瘤患者靶向用药。

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检验医师

FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或 DNA 纤维切片上的靶 DNA 与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶 DNA 与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测 DNA 进行定性、定量或相定位分析。
2．实验流程
FISH 样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→（染色体显带）→荧光显微镜检测→结果分析。
3．特点
FISH 技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:
1、荧光试剂和探针经济、安全；
2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；
3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；
4、FISH 可定位长度在 1kb 的 DNA 序列，其灵敏度与放射性探针相当；
5、多色 FISH 通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；
6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体 DNA 的结构。
缺点：不能达到 100%杂交，特别是在应用较短的 cDNA 探针时效率明显下降。
该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。