新研制的一个体外诊断试剂，有多难？

营养师

来源：知乎
        生物标志物，至今还没有一个非常明确的定义，权威的定义是NIH在1998年的定义：a characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biologic processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeutic intervention。
        肿瘤标志物是生物标志物中的一类，可以是蛋白质、DNA、RNA，我们以蛋白质肿瘤标志物为例，先看一组数据，在美国，以最近十年的数据，平均1.5年，有一种新的肿瘤标志物检测技术被FDA批准，而这些蛋白肿瘤标志物，绝大多数是基于免疫学反应来检测的（ELISA和免疫组化）。
        一个蛋白肿瘤标志物，从发现到临床实际应用，要经历哪些？在Pubmed上文献检索显示，用肿瘤标志物做为关键词，有230000篇文献，最后FDA批准了23种临床应用的蛋白类肿瘤标志物，等于10000篇论文，转化1个蛋白类肿瘤标志物。
        以上的三段文字，摘录至王守业总的科学网博客。这些基础研究工作，一般要经历数十年，采用各种方法学，进行“定性”式的研究，发现某个蛋白具有“潜在”临床应用价值，这个过程漫长且艰辛，我们只能对于研究者献上崇高敬意，暂且不论这个过程。我们以一个被明确定位有潜力做为蛋白类肿瘤标志物，以最常用的双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）为例，看开发一个可以应用于临床（可以是早筛、伴随诊断、药物评估、预后等用途）的检测方法，是一个什么样的过程。
        酶联免疫法的基础是抗体，理论上应用两株与抗原不同表位反应的抗体，在没有空间位阻情况下，可以形成固相抗体-抗原-酶标抗体的“三明治”免疫复合物，由此依据校准品浓度和吸光度，对未知抗原浓度进行定量检测。要完成这种检测方法的开发，必须满足五个条件：
1、抗体是特异性的。
2、两株抗体结合抗原的时候，是没有空间位阻的。
3、两株抗体都是针对抗原的主流位点，不会产生漏检。
4、合适的检测体系。
5、合适的临床试验方案
        以单克隆抗体制备为例，要用到免疫原和筛选原，对一个新发现的抗原，很难进行提取纯化天然抗原的，一般是先通过基因工程技术，制备重组蛋白，免疫小鼠，通过细胞工程手段，获得杂交瘤，生产单克隆抗体。再研发检测试剂盒，进行临床试验，确认可用于的临床应用。这个技术路线是非常成熟，甚至是在生命科学领域，国内与国际差距最小的一个技术。
        一个试剂盒，满足体外诊断要求的话，一般有两个主要指标：特异性和敏感性。简单地说，一定要区别“疾病”和“正常”，并且，在疾病发生前，越早出现越好，在疾病恢复后，越早消失越好，在疾病发展进程中，随病情变化越相关越好，由此贯穿疾病的早期筛查、疗效评价、预后等各个环节。但是，一般很难有如此优秀的标志物，能实现某一应用，就非常不错。
        我们不去展开这其中的细节，归结为两点：试剂盒研发和临床试验验证。我们分为模仿性体外诊断试剂开发和新研制体外诊断试剂开发两类，分别简单分析一下。
        模仿性体外诊断试剂开发比较容易理解，我们90%以上的体外诊断试剂研发人员，是在从事这个工作，筛选原料、调整配方、建立体系，最终的一个目的：与已有上市的同品种，同时双盲测试一定数量的符合要求的临床样本，检测结果具有很好的相关性、很高的符合率，满足上市要求。用指导原则的原话说：“采用试验用体外诊断试剂与已上市产品，针对临床样本进行比较研究试验，证明试验用体外诊断试剂与已上市产品等效。”

        做过模仿性体外诊断试剂开发的人员都知道，一个诊断试剂盒，要符合申报上市的要求，原材料占70%、工艺占20%、思路占10%。（这个在我们微信公众号平台：abbestab，有详细论述）。所以模仿性开发，一般是先大范围筛选原料，获得初步可行的候选原料，进入后续的工艺开发，配方调整，直至性能符合申报上市的要求。这个过程，不用考虑受试者情况，只是做一个跟比对试剂相关性的研究，比较简单，可以说，只要有合适原料，做一个产品不难（当然，做卓越的产品另论）。这是在“待测物”浓度水平的一个研究。

        新研制体外诊断试剂开发，试剂盒开发工作跟上面相同，在临床试验不同。确认“金标准”，用“金标准”确定疾病组、对照组的受试者入组要求。采用双盲法同步检测，计算试验用体外诊断试剂检测结果与“金标准”判断结果符合或者差异程度的统计学指标，然后进行评价。
        新研制的体外诊断试剂开发，要花大量时间在疾病组、正常组的金标准确认，受试者的入组登记、治疗随访、跟踪研究，这只是一个疾病层面，受试者的检测体液内，没有一个明确的“待测物”浓度水平。不同病例，如症状典型和非典型的，病程早、中、晚期的，病情轻、中、重型的，不同性别、不同年龄层次，以及相类似的疾病，都会对这个“待测物”产生影响。
        新研制的体外诊断试剂，开发过程就很复杂，首先要获得很好的抗原，去制备足够多的抗体，然后应用足够多金标准确证的样本，对抗体进行系统的评价，获得具有临床相关性的候选抗体，再开发成检测试剂，进行初步临床试验，评价试剂效果，再进行后续临床试验，扩大试验样本。这是一个动态、不断修正，甚至推倒重来的过程。
        而且，对于每个预期用途的疾病类型，每个应用范围：比如早筛、病情监测、疗效评价、预后等，都要做相应的临床试验，并得到确认可靠的试验结果，才能进行应用。所以，能够将一个潜在生物标志物，成功完成临床应用确证，申报成一个新研制的体外诊断试剂，是非常不容易的过程。许多优秀的生物标志物，比如肌钙蛋白（cTnI）、抗穆勒氏管激素（AMH），都是科学家倾其毕生精力，研究并转化的结果。
        因此，一个新研制的体外诊断试剂，都会有比较局限的疾病检查适应症、比较单一的应用范围（早筛、病情监测、疗效评价、预后），随着后续临床试验的深入与扩展，再获得新的适应症和新的应用范围。
        开发一个新研制的体外诊断试剂，着实非常不易，相关报道一定要明确适应症和应用范围，相关科室一定要严守适应症和应用范围这条红线，一旦跨越这个界限，就是误导、夸大、滥用、超用。可惜，细究目前的检测项目，这种情况比比皆是。

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