免疫诊断试剂的研制

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来源：知乎
免疫诊断试剂是由特定抗原、抗体或有关生物物质制成的诊断试剂，根据方法学不同可以分为凝集反应，沉淀反应，补体结合反应，标记免疫反应。
其中标记免疫诊断试剂根据标记物不同可分为同位素，酶，荧光素与荧光蛋白，发光物质，生物素，亲和素，纳米颗粒等标记试剂。
标记免疫测定技术包括放射免疫，酶免疫，荧光免疫，化学发光免疫等多种试验方法，其核心都是将不同示踪物与特异性抗原或抗体交联，通过示踪物含量或活性，间接测定目的抗原或抗体。常见的示踪物包括酶，荧光物质，化学发光物质，生物素/亲和素和纳米颗粒。
酶
标记免疫常用的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶；常用酶的标记方法有戊二醛交联法，过碘酸钠氧化法和异型双功能交联法。


荧光素与荧光蛋白
荧光是由荧光物质吸收外界能量发生电子跃迁，然后以光量子形式释放出能量而形成。荧光素是具有共轭双键体系结构的化合物，受到紫外线照射时，其吸收外界能量后处于基态的电子被激发到较高的能级而处于激发态，激发态的电子很快回到较低的激发态，通过发射光量子而回到基态的各个不同振动能级，从而产生荧光。
下表列举了常见的荧光素和荧光蛋白：


荧光素标记蛋白是将荧光素与待标记蛋白以化学共价键的方式结合而成。常用的荧光蛋白标记方法有搅拌法，透析法。
发光物质
发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可以分为光照发光，生物发光，化学发光。
常见的化学发光剂包括直接化学发光剂和酶促反应发光剂。直接化学发光剂在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗体或抗原，在发光免疫分析中不需要酶的催化，可直接参与发光反应，常见的有吖啶酯和三联必定钌。酶促反应发光剂，利用标记酶的催化作用，使底物发光，主要有辣根过氧化酶和碱性磷酸酶。
发光剂的标记方法包括直接偶联和间接偶联，直接偶联通过碳二亚胺缩合法（EDC），过碘酸钠氧化，重氮盐偶联法。间接偶联法主要N-羟基琥珀酰胺亚胺活化法。
生物素和亲和素
生物素和亲和素系统BAS是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合两者可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，他们结合迅速，专一稳定，并且有多级放大效应。
生物素广泛存在于动植物组织中，从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量为244.31kd，又称维生素H或B7。生物素分子有两个环状结构，其中I环是咪唑酮环，于亲和素结合的主要部位，II环是噻吩环，结合抗体。
亲和素包括源于卵清蛋白的卵白亲和素和源于链霉菌的链霉亲和素。亲和素富含色氨酸，色氨酸与生物素的咪唑酮环结合，亲和力极强，比抗原，抗体亲和力至少提高10000倍。
纳米颗粒
纳米颗粒是指人工制造的，大小不超过100nm的微型颗粒。常见的纳米颗粒主要有胶体金，胶体硒，乳胶颗粒等。常见的乳胶微球有聚苯乙烯微球、荧光微球和磁性微球。
在免疫诊断试剂的研制方面主要是对其反应模式的选择，缓存体系的选择。反应载体和添加剂的选择，生物活性原料选择与工作浓度确定。抗原抗体的结合反应可以分为以下5类：1、颗粒性抗原与相应抗体结合所产生的凝集反应；2、可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应；3、抗原抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应；4、细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；5、标记免疫的抗原抗体反应。免疫试剂中常用的缓冲体系为碳酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液。大多数抗原抗体反应的最适pH是6-8，抗体免疫球蛋白的等电点为4.8-6.6。常见的固相支持物有聚苯乙烯，聚氯乙烯，硝酸纤维素膜和磁性聚苯乙烯，具有一定的刚性和柔性，且不予其他物质发生反应。常见添加剂包括防腐剂，表面活性剂，生物活性物质，电解质和阻断剂等。生物活性原料的选择主要是针对抗原抗体的选择，都有天然的和人工制备的，人工制备的抗原有合成的，结合的以及基因重组的，人工制备的抗体有多克隆，单克隆和基因工程抗体。工作浓度的确定即抗原抗体反应的最适浓度，当抗原浓度过高时会出现钩状效应。反应条件的优化主要针对的是酸碱度，离子强度，温度，抗原抗体比例，反应时间等进行调整。

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